Un protocole in vitro pour évaluer les niveaux de microARN, les fonctions et les gènes cibles associés dans les cellules tumorales
Summary
Ce protocole utilise une réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR) basée sur la sonde, un prédisme de sulforhodamine B (SRB), 3′ régions non traduites (3′ UTR) et un résultat de luciferase pour vérifier les gènes cibles d’un miRNA d’intérêt et pour comprendre les fonctions des miRNAs.
Abstract
Les microARN (miARN) sont de petits ARN régulateurs qui sont reconnus pour moduler de nombreuses voies de signalisation intracellulaire dans plusieurs maladies, y compris les cancers. Ces petits ARN régulateurs interagissent principalement avec les 3′ régions non traduites (3′ UTR) de leurs ARN messagers cibles (ARNM) aboutissant finalement à l’inhibition des processus de décodage des ARNm et à l’augmentation des dégradations de l’ARNm cible. Basé sur les niveaux d’expression et les fonctions intracellulaires, les miRNAs peuvent servir de facteurs régulateurs des ARNm oncogènes et suppresseurs de tumeurs. L’identification des gènes cibles de bonne foi d’un miRNA parmi des centaines, voire des milliers de cibles prédites par le calcul est une étape cruciale pour discerner les rôles et les mécanismes moléculaires de base d’un miRNA d’intérêt. Divers programmes de prédiction cible miRNA sont disponibles pour rechercher les interactions possibles miRNA-mRNA. Cependant, la question la plus difficile est de savoir comment valider les gènes cibles directs d’un miRNA d’intérêt. Ce protocole décrit une stratégie reproductible des méthodes clés sur la façon d’identifier les cibles miRNA liées à la fonction d’un miRNA. Ce protocole présente un guide pratique sur les procédures étape par étape pour découvrir les niveaux de miRNA, les fonctions et les ARNc cibles connexes à l’aide de la réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR) à base de sonde, d’un test de sulforhodamine B (SRB) à la suite d’une transfétion miRNA imitant la transfection , génération de courbe dose-réponse, et test de luciferase avec le clonage de 3′ UTR d’un gène, qui est nécessaire pour une bonne compréhension des rôles des miRNAs individuels.
Introduction
Les microARN (miARN) sont les petites ARN réglementaires qui modulent principalement le processus de traduction et de dégradation des ARN messagers (ARM) en réagissant aux 3′ régions non traduites (3′ UTR) dans les gènes cibles de bonne foi1. L’expression des miARN peut être réglée par des mécanismes transcriptionnels et post-transcriptionnels. Le déséquilibre de ces mécanismes de réglementation apporte des niveaux d’expression miRNAs incontrôlés et distinctifs dans de nombreuses maladies, y compris les cancers2. Un seul miRNA peut avoir de multiples interactions avec divers ARNm. En conséquence, un ARNm individuel peut être contrôlé par divers miRNAs. Par conséquent, les réseaux de signalisation intracellulaire sont indirectement influencés par des miARN exprimés de façon distinctive par lesquels les troubles physiologiques et les maladies peuvent être initiés et détériorés2,3,4, 5 Annonces , 6. Bien que l’expression altérée des miARN ait été observée dans divers types de cancers, les mécanismes moléculaires qui modulent les manières des cellules cancéreuses en conjonction avec des miARN sont encore largement inconnus.
L’accumulation des preuves a montré que les rôles oncogènes ou tumorales-suppresseurs des miARN dépendent des types de cancers. Par exemple, en ciblant la boîte de tête de fourche o3 (FOXO3), miR-155 favorise la prolifération cellulaire, la métastasie et la chimiorésistance du cancer colorectal7,8. En revanche, la restriction de l’invasion de cellules de glioma est induite par miR-107 parl’intermédiaire de la régulation de la protéine d’homologaire neurogène d’entaille de locus 2 (NOTCH2) expression 9. L’évaluation des interactions miRNA-cible en relation avec les fonctions miRNA est une partie indispensable pour mieux comprendre comment les miARN régulent divers processus biologiques dans les états sains et malades10. En outre, la découverte de cibles de bonne foi (s) de miARN peut en outre fournir une stratégie affinée pour une thérapie miRNA-basée avec divers médicaments anticancéreux. Cependant, le principal défi dans le domaine des miRNAs est l’identification de cibles directes des miRNAs. Ici, des méthodes détaillées sont présentées comme des approches expérimentales reproductibles pour la détermination du gène cible miRNA. La conception expérimentale réussie de l’identification cible miRNA comporte diverses étapes et considérations (figure 1). La comparaison des niveaux mûrs de miRNA dans les cellules de tumeur et les cellules normales peut être l’une des procédures communes pour sélectionner un miRNA d’intérêt (Figure 1A). L’étude fonctionnelle d’un miRNA sélectionné pour détecter les effets d’un miRNA sur la prolifération cellulaire est importante pour réduire la liste des meilleures cibles candidates potentielles d’un miRNA d’intérêt (Figure 1B). Sur la base des fonctions expérimentalement validées des miARN, un examen systématique de la littérature et de la base de données en compagnie d’un programme de prédiction cible miRNA est nécessaire pour rechercher les informations les plus pertinentes sur les fonctions génétiques (figure 1C). L’identification de gènes cibles réels d’un miRNA d’intérêt peut être réalisée en mettant en œuvre des expériences telles que l’analyse de la luciferase avec le clonage de 3′ UTR d’un gène, PCR en temps réel, et le ballonnement occidental (Figure 1D). L’objectif du protocole actuel est de fournir des méthodes complètes d’expériences clés, la réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR) basée sur la sonde, l’analyse de sulforhodamine B (SRB) suivant un miRNA imitant la transfection, la génération de courbes dose-réponse, et luciferase avec le clonage de 3′ UTR d’un gène. Le protocole actuel peut être utile pour une meilleure compréhension des fonctions des miARN individuels et de l’implication d’un miRNA dans la thérapie contre le cancer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les stratégies pour la détermination des cibles de miRNA de bonne foi avec les fonctions d’un miRNA d’intérêt sont indispensables pour la compréhension des rôles multiples des miRNAs. L’identification des gènes cibles miRNA peut être une ligne directrice pour interpréter les événements de signalisation cellulaire modulées par des miARN dans une cellule. Un dévoilement des gènes cibles fonctionnellement importants des miARN peut fournir les connaissances fondamentales pour développer une thérapie miRNA-bas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le Programme de recherche en sciences fondamentales par l’intermédiaire de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le ministère de l’Éducation (2017R1D1A3B03035662); et le Fonds de recherche universitaire Hallym, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6X DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8X Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
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