Ein In-Vitro-Protokoll zur Bewertung von MicroRNA-Spiegeln, -Funktionen und assoziierten Zielgenen in Tumorzellen
Summary
Dieses Protokoll verwendet eine sondenbasierte Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einen Sulforhodamin-B-Assay (SRB), 3′ unübersetztes Klonen (3′ UTR) und einen Luziferase-Assay, um die Zielgene einer miRNA von Interesse zu verifizieren und die Funktionen von miRNAs zu verstehen.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind kleine regulatorische RNAs, die anerkannt sind, um zahlreiche intrazelluläre Signalwege bei mehreren Krankheiten, einschließlich Krebserkrankungen, zu modulieren. Diese kleinen regulatorischen RNAs interagieren hauptsächlich mit den 3′ unübersetzten Regionen (3′ UTR) ihrer Zielboten-RNAs (mRNAs), was letztlich zur Hemmung von Dekodierungsprozessen von mRNAs und zur Erweiterung von Ziel-mRNA-Abbauarten führt. Basierend auf den Expressionsniveaus und intrazellulären Funktionen sind miRNAs in der Lage, als regulatorische Faktoren für onkogene und tumorsuppressive mRNAs zu dienen. Die Identifizierung von gutgläubigen Zielgenen einer miRNA unter Hunderten oder sogar Tausenden von rechnerisch vorhergesagten Zielen ist ein entscheidender Schritt, um die Rollen und grundlegenden molekularen Mechanismen einer miRNA von Interesse zu erkennen. Verschiedene miRNA-Zielvorhersageprogramme stehen zur Verfügung, um mögliche miRNA-mRNA-Interaktionen zu suchen. Die schwierigste Frage ist jedoch, wie direkte Zielgene einer miRNA von Interesse validiert werden können. Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Strategie von Schlüsselmethoden zur Identifizierung von miRNA-Zielen im Zusammenhang mit der Funktion einer miRNA. Dieses Protokoll enthält eine praktische Anleitung zu Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Aufdeckung von miRNA-Spiegeln, -Funktionen und zugehörigen Ziel-mRNAs unter Verwendung der sondenbasierten Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Sulforhodamin B (SRB)-Assay nach einer miRNA-Mimiktransfektion , Dosis-Wirkungs-Kurvengenerierung und Luziferase-Assay zusammen mit dem Klonen von 3′ UTR eines Gens, das für ein richtiges Verständnis der Rollen einzelner miRNAs notwendig ist.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) sind die kleinen regulatorischen RNAs, die hauptsächlich den Prozess der Übersetzung und des Abbaus von Messenger RNAs (mRNAs) modulieren, indem sie auf die 3′ unübersetzten Regionen (3′ UTR) in gutgläubigen Zielgenen1reagieren. Die Expression von miRNAs kann durch transkriptionelle und posttranskriptionelle Mechanismen reguliert werden. Das Ungleichgewicht solcher Regulierungsmechanismen führt zu unkontrollierten und ausgeprägten miRNAs Expressionsniveaus bei zahlreichen Krankheiten, einschließlich Krebsarten2. Eine einzelne miRNA kann mehrere Wechselwirkungen mit verschiedenen mRNAs haben. Entsprechend kann eine einzelne mRNA durch verschiedene miRNAs gesteuert werden. Daher werden intrazelluläre Signalnetze aufwendig durch markant exprimierte miRNAs beeinflusst, durch die physiologische Störungen und Krankheiten initiiert und verschlechtert werden können2,3,4, 5 , 6. Obwohl die veränderte Expression von miRNAs bei verschiedenen Krebsarten beobachtet wurde, sind die molekularen Mechanismen, die die Manieren von Krebszellen in Verbindung mit miRNAs modulieren, noch weitgehend unbekannt.
Die Akkumulierenden Beweise zeigen, dass die onkogenen oder tumorsuppressiven Rollen von miRNAs von den Krebsarten abhängen. Zum Beispiel, indem for targeting Gabelkopf-Box o3 (FOXO3), miR-155 fördert die Zellproliferation, Metastasierung, und Chemoresistenz von Dickdarmkrebs7,8. Im Gegensatz dazu wird die Restriktion der Gliomzellinvasion durch miR-107 durch die Regulation der neurogenen Locus Kerch Homolog Protein 2 (NOTCH2) Expression9induziert. Die Bewertung von miRNA-Ziel-Wechselwirkungen im Zusammenhang mit miRNA-Funktionen ist ein unverzichtbarer Bestandteil, um besser zu verstehen, wie miRNAs verschiedene biologische Prozesse sowohl in gesunden als auch in kranken Zuständen regulieren10. Darüber hinaus kann die Entdeckung von gutgläubigen Zielen von miRNAs eine fein abgestimmte Strategie für eine miRNA-basierte Therapie mit verschiedenen Krebsmedikamenten bieten. Die größte Herausforderung im Bereich der miRNAs ist jedoch die Identifizierung direkter Ziele von miRNAs. Hier werden detaillierte Methoden als reproduzierbare experimentelle Ansätze für die miRNA-Zielgenbestimmung präsentiert. Erfolgreiches experimentelles Design für die miRNA-Zielidentifikation umfasst verschiedene Schritte und Überlegungen (Abbildung 1). Der Vergleich der reifen miRNA-Spiegel in Tumorzellen und normalen Zellen kann eine der üblichen Verfahren zur Auswahl einer miRNA von Interesse sein (Abbildung 1A). Die funktionelle Studie einer ausgewählten miRNA zum Nachweis der Auswirkungen einer miRNA auf die Zellproliferation ist wichtig, um die Liste der besten potenziellen Kandidatenziele einer miRNA von Interesse einzugrenzen (Abbildung 1B). Basierend auf den experimentell validierten Funktionen von miRNAs ist eine systematische Überprüfung von Literatur und Datenbank in Unternehmen mit einem miRNA-Zielvorhersageprogramm erforderlich, um die relevantesten Informationen über Genfunktionen zu durchsuchen (Abbildung 1C). Die Identifizierung von realen Zielgenen einer miRNA von Interesse kann durch die Durchführung von Experimenten wie dem Luziferase-Assay zusammen mit dem Klonen von 3′ UTR eines Gens, Echtzeit-PCR und Western Blotting (Abbildung 1D) erreicht werden. Ziel des aktuellen Protokolls ist es, umfassende Methoden für Schlüsselexperimente, die sonsonbasierte Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Sulforhodamin B (SRB) nach einer miRNA-Mimiktransfektion, Dosis-Wirkungs-Kurvengenerierung und luziferase-Assay zusammen mit dem Klonen von 3′ UTR eines Gens. Das aktuelle Protokoll kann für ein besseres Verständnis der Funktionen einzelner miRNAs und die Implikation einer miRNA in der Krebstherapie nützlich sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Strategien zur Bestimmung von gutgläubigen miRNA-Zielen mit den Funktionen einer miRNA von Interesse sind für das Verständnis mehrerer Rollen von miRNAs unverzichtbar. Die Identifizierung von miRNA-Zielgenen kann eine Richtschnur für die Interpretation der von miRNAs in einer Zelle modulierten Zellsignalereignisse sein. Eine Enthüllung funktionell wichtiger Zielgene von miRNAs kann das grundlegende Wissen zur Entwicklung einer miRNA-basierten Therapie bei Krebs liefern.
Mehrere Methoden w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom Basic Science Research Program von der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, die vom Bildungsministerium (2017R1D1A3B03035662) gefördert wurde. und Hallym University Research Fund, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6X DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8X Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
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