פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול
Summary
פרוטוקול זה משתמש ב-החללית מבוסס בזמן אמת בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), שיטת sulforhodamine B (SRB), 3 ‘ אזורים לא מתורגמים (3 ‘ UTR) שיבוט, ושיטת לוציפראז לאמת את הגנים היעד של miRNA עניין ולהבין את הפונקציות של Mirna.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) הם RNAs הרגולציה קטנים אשר מזוהים לווסת מסלולים מסוימים של איתות תאיים במספר מחלות כולל סרטן. אלה RNAs הרגולציה קטנים בעיקר אינטראקציה עם 3 ‘ אזורים לא מתורגם (3 ‘ UTR) של שליח היעד שלהם RNAs (mRNAs) בסופו של דבר וכתוצאה מכך עיכוב תהליכי פענוח של mRNAs ואת הגדלת Mrnas היעד degradations. בהתבסס על רמות הביטוי ופונקציות תאיים, miRNAs מסוגלים לשמש גורמי רגולציה של mRNAs ומדכאים הגידול המדכא. זיהוי של גנים היעד בתום המטרה של miRNA בין מאות או אפילו אלפי מטרות חזוי מבחינה חישובית הוא צעד מכריע כדי להבחין את התפקידים ומנגנונים מולקולאריים בסיסיים של מירנה של עניין. תוכניות מסוימות לחיזוי היעד miRNA זמינים כדי לחפש אינטראקציות miRNA-mRNA אפשרי. עם זאת, השאלה המאתגרים ביותר היא כיצד לאמת גנים מטרה ישירה של miRNA עניין. פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה הניתן לפונקציה של שיטות מפתח כיצד לזהות יעדי miRNA הקשורים לפונקציה miRNA. פרוטוקול זה מציג מדריך מעשי על הליכים צעד אחר צעד כדי לחשוף רמות miRNA, פונקציות, ו-mRNAs הקשורות היעד באמצעות הבדיקה מבוסס בזמן אמת התגובה שרשרת פולימראז (PCR), sulforhodamine B (SRB) שיטת בעקבות מחקה מחקים העברה , מינון התגובה עקומת הדור, ושיטת לוציפראז יחד עם שיבוט של 3 ‘ UTR של גן, אשר הכרחי להבנה נכונה של התפקידים של miRNAs בודדים.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) הם RNAs הרגולציה קטן כי בעיקר לווסת את תהליך התרגום והשפלה של RNAs שליח (mRNAs) על ידי התגובה ל 3 ‘ אזורים לא מתורגם (3 ‘ UTR) בתום היעד לאחד גנים1. ביטוי של miRNAs יכול להיות מוסדר על ידי מנגנונים שלאחר ההמרה. חוסר האיזון של מנגנונים כגון מביא בלתי מבוקרת וייחודית רמות הביטוי miRNAs במחלות רבות כולל סרטן2. ל-miRNA אחת יכול להיות מספר אינטראקציות עם mRNAs מגוונות. בהתאמה, mRNA הפרט יכול להיות נשלט על ידי miRNAs שונים. לכן, רשתות איתות תאיים מושפע באופן מסובכת על ידי ביטוי באופן מתבטא על ידי הפרעות פיסיולוגיים ומחלות ניתן ליזום והידרדר2,3,4, מיכל 5 , 6. למרות הביטוי השונה של mirnas נצפתה סוגים שונים של סרטן, המנגנונים המולקולריים לווסת את הנימוסים של תאים סרטניים בשילוב עם mirnas עדיין לא ידוע ברובו.
צבירת ראיות הראה כי התפקידים אונגניים או מדכאים הגידול של miRNAs תלוי בסוגי סרטן. לדוגמה, על-ידי פילוח forkhead box o3 (FOXO3), מיר-155 מקדם את התפשטות התא, גרורות, ו-cheמורשת של סרטן המעי הגס7,8. לעומת זאת, ההגבלה של הפלישה התאים glioma נגרמת על ידי מיר-107 באמצעות התקנה של חלבון מקור נוירוגניים הומולוג 2 (NOTCH2) ביטוי9. הערכה של האינטראקציות miRNA-target בקשר עם פונקציות miRNA הוא חלק הכרחי כדי להבין טוב יותר כיצד Mirna לווסת תהליכים ביולוגיים שונים במדינות בריאות וחולה10. בנוסף, הגילוי של היעד בתום האדם (s) של miRNAs יכול עוד לספק אסטרטגיה מכוון עדין עבור טיפול מבוסס Mirnas עם תרופות נגד סרטן שונים. עם זאת, האתגר העיקרי בתחום של miRNAs הוא זיהוי של יעדים ישירים של miRNAs. כאן, שיטות מפורטות מוצגים כגישות ניסיוני לצורך הגדרה גנטית היעד miRNA. תכנון ניסיוני מוצלח עבור זיהוי יעד miRNA כרוך בשלבים שונים ושיקולים (איור 1). השוואה של רמות miRNA בוגרת בתאי הגידול תאים נורמליים יכול להיות אחד ההליכים השכיחים כדי לבחור miRNA עניין (איור 1A). המחקר הפונקציונלי של miRNA שנבחרו כדי לזהות את ההשפעות של miRNA על התפשטות התא חשוב לצמצם את רשימת המטרות המועמדים הפוטנציאליים הטובים ביותר של miRNA עניין (איור 1B). מבוסס על פונקציות מאומת הניסויים של miRNAs, סקירה שיטתית של ספרות ומסד נתונים בחברה עם תוכנית חיזוי יעד Mirnas נדרש כדי לחפש את המידע הרלוונטי ביותר על פונקציות גן (איור 1C). הזיהוי של גנים היעד האמיתי של mirna העניין יכול להיות מושגת על ידי יישום ניסויים כגון שיטת ללוציפראז יחד עם שיבוט של 3 ‘ utr של גן, PCR בזמן אמת, ו בלוק מערבי (איור 1d). המטרה של הפרוטוקול הנוכחי היא לספק שיטות מקיפות של ניסויים מרכזיים, את תגובת שרשרת פולימראז מבוסס בזמן אמת (PCR), sulforhodamine B (SRB) שיטה בעקבות מחקים miRNA מחקה, מינון תגובה הדור עקומת, ו שיטת לוציפראז יחד עם שיבוט של 3 UTR של גן. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות שימושי להבנה טובה יותר של הפונקציות של miRNAs בודדים ואת המשמעות של Mirnas בטיפול בסרטן.
Protocol
Representative Results
Discussion
אסטרטגיות לקביעת מטרות miRNA בתום ובלבד עם פונקציות של מירנה של עניין הם חיוניים להבנת תפקידים מרובים של Mirna. זיהוי של גנים היעד miRNA יכול להיות מנחה לפענוח התא איתות אירועים מאופנן על ידי Mirna בתא. החשיפה של גנים מטרה חשובה מבחינה פונקציונלית של miRNAs יכול לספק את הידע הבסיסי לפתח טיפול מבוססי Mirna…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית בסיסית מחקר המדע באמצעות קרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2017R1D1A3B03035662); הקרן לחקר האוניברסיטה, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6X DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8X Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
- Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
- Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
- Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
- Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
- Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
- Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
- Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
- Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
- van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
- Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
- Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
- Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
- Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
- Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
- Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
- Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
- Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
- Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
- Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
- Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
- Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. 암 연구학. 70 (2), 440-446 (2010).
- Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).
