Un protocollo in vitro per la valutazione dei livelli, delle funzioni e dei geni target associati nelle cellule tumorali
Summary
Questo protocollo utilizza una reazione a catena di polimerasi in tempo reale basata su sonda (PCR), un saggio SRB (sulforhodamine B), una clonazione di 3 regioni non tradotte (3′ UTR) e un analisi luciferasi per verificare i geni bersaglio di un miRNA di interesse e per comprendere le funzioni dei miRNA.
Abstract
I microRNA (miRNA) sono piccoli RNA regolatori che sono riconosciuti per modulare numerose vie di segnalazione intracellulare in diverse malattie tra cui i tumori. Questi piccoli RNA normativi interagiscono principalmente con le regioni non tradotte 3′ dei loro RNA messaggeri bersaglio (mRNA) con conseguente inibizione dei processi di decodifica degli mRNA e l’aumento delle degradazioni di mRNA bersaglio. Sulla base dei livelli di espressione e delle funzioni intracellulari, i miRNA sono in grado di fungere da fattori regolatori di mRNA oncogeni e soppressivi. L’identificazione dei geni bersaglio in buona fede di un miRNA tra centinaia o addirittura migliaia di bersagli computazionalmente previsti è un passo cruciale per discernere i ruoli e i meccanismi molecolari di base di un miRNA di interesse. Sono disponibili vari programmi di previsione mirati a miRNA per cercare possibili interazioni miRNA-mRNA. Tuttavia, la domanda più impegnativa è come convalidare i geni bersaglio diretti di un miRNA di interesse. Questo protocollo descrive una strategia riproducibile dei metodi chiave su come identificare gli obiettivi di miRNA correlati alla funzione di un miRNA. Questo protocollo presenta una guida pratica sulle procedure passo-passo per scoprire i livelli di miRNA, le funzioni e gli mRNA bersaglio correlati utilizzando la reazione a catena di polimerasi in tempo reale basata su sonda (PCR), il saggio sulla sulforhodamina B (SRB) a seguito di una trasfezione mimica miRNA , generazione di curve dose-risposta, e l’assaggio di luciferasi insieme alla clonazione di 3′ UTR di un gene, che è necessario per una corretta comprensione dei ruoli dei singoli miRNA.
Introduction
I microRNA (miRNA) sono i piccoli RNA regolatori che modulano principalmente il processo di traduzione e degrado degli RNA messaggeri (mRNA) reagendo alle regioni 3 ‘ non tradotte (3’ UTR) nei geni bersaglio in buona fede1. L’espressione dei miRNA può essere regolata da meccanismi trascrizionali e post-trascrizione. Lo squilibrio di tali meccanismi normativi porta livelli di espressione incontrollati e distintivi dei miRNA in numerose malattie, tra cui i tumori2. Un singolo miRNA può avere più interazioni con diversi mRNA. Di conseguenza, un singolo mRNA può essere controllato da vari miRNA. Pertanto, le reti di segnalazione intracellulare sono influenzate da miRNA espressi in modo distintivo attraverso i quali i disturbi fisiologici e le malattie possono essere avviati e deteriorati2,3,4, 5 Del numero 3( , 6. Sebbene l’espressione alterata dei miRNA sia stata osservata in vari tipi di cancro, i meccanismi molecolari che modulano le maniere delle cellule tumorali in combinazione con i miRNA sono ancora in gran parte sconosciuti.
Sempre più prove hanno dimostrato che i ruoli oncogeni o soppressivi dei miRNA dipendono dai tipi di cancro. Ad esempio, prendendo di mira la box forcella o3 (FOXO3), miR-155 promuove la proliferazione cellulare, la metastasi e la chemoresistance del cancro colorettale7,8. Al contrario, la restrizione dell’invasione delle cellule glioma è indotta dal miR-107 attraverso la regolazione dell’espressione neurogenica di locus notch omolog proteina 2 (NOTCH2)9. La valutazione delle interazioni miRNA-bersaglio in relazione alle funzioni di miRNA è una parte indispensabile per comprendere meglio come i miRNA regolano i vari processi biologici in stati sani e malati10. Inoltre, la scoperta di bersagli in buona fede dei miRNA può fornire ulteriormente una strategia messa a punto per una terapia basata su miRNA con vari farmaci anti-cancro. Tuttavia, la sfida principale nel campo dei miRNA è l’identificazione di obiettivi diretti di miRNA. Qui, i metodi dettagliati sono presentati come approcci sperimentali riproducibili per la determinazione del gene bersaglio miRNA. Il successo della progettazione sperimentale per l’identificazione del bersaglio del miRNA comporta vari passaggi e considerazioni (Figura 1). Il confronto dei livelli di miRNA maturi nelle cellule tumorali e nelle cellule normali può essere una delle procedure comuni per selezionare un miRNA di interesse (Figura 1A). Lo studio funzionale di un miRNA selezionato per rilevare gli effetti di un miRNA sulla proliferazione cellulare è importante per restringere l’elenco dei migliori potenziali bersagli candidati di un miRNA di interesse (Figura 1B). Sulla base delle funzioni sperimentalmente convalidate dei miRNA, è necessaria una revisione sistematica della letteratura e del database in azienda con un programma di previsione del target di miRNA per cercare le informazioni più rilevanti sulle funzioni geniche (Figura 1C). L’identificazione dei geni bersaglio reali di un miRNA di interesse può essere ottenuta implementando esperimenti come il saggio luciferasi insieme alla clonazione di 3′ UTR di un gene, PCR in tempo reale e gonfiore occidentale (Figura 1D). L’obiettivo dell’attuale protocollo è quello di fornire metodi completi di esperimenti chiave, la reazione a catena di polimerasi in tempo reale basata su sonda (PCR), il saggio sulla sulforhodamina B (SRB) in seguito a una trasfezione mirnamista, generazione di curve dose-risposta e lucidferasi insieme alla clonazione di 3′ UTR di un gene. Il protocollo attuale può essere utile per una migliore comprensione delle funzioni dei singoli miRNA e dell’implicazione di un miRNA nella terapia del cancro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le strategie per la determinazione dei bersagli del miRNA in buona fede con le funzioni di un miRNA di interesse sono indispensabili per la comprensione di più ruoli dei miRNA. L’identificazione dei geni bersaglio di miRNA può essere una linea guida per interpretare gli eventi di segnalazione cellulare modulati dai miRNA in una cellula. Una presentazione di geni bersaglio funzionalmente importanti dei miRNA può fornire le conoscenze fondamentali per sviluppare una terapia basata su miRNA nel cancro.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal Basic Science Research Program attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal Ministero dell’Istruzione (2017R1D1A3B03035662); e Hallym University Research Fund, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6X DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8X Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Park, J. K., et al. MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy. Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).
- Henry, J. C., et al. miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).
- Khoshinani, H. M., et al. Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line. Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).
- Gao, Y., et al. MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3. Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).
- Catanzaro, G., et al. Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs). International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).
- Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. The hunting of targets: challenge in miRNA research. Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).
- Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells. Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).
- Xia, X., et al. Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN. American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).
- Lee, K. H., et al. Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer. Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).
- van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes. 8, 47 (2015).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS One. 5 (4), e10202 (2010).
- Wu, L., Belasco, J. G. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).
- Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay. Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).
- Ma, Z., et al. Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation. Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).
- Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).
- Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches. Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).
- Lee, E. J., et al. Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer. International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).
- Nuovo, G. J., et al. A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets. Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).
- Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44 (1), 31-38 (2008).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).
- Orellana, E. A., Kasinski, A. L. Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation. Bio Protocol. 6 (21), (2016).
- Lawrie, C. H. MicroRNAs in hematological malignancies. Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. MicroRNAs and anticancer drugs. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).
- Moeng, S., et al. MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide. Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).
- Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. 암 연구학. 70 (2), 440-446 (2010).
- Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing. Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).
