腫瘍細胞におけるマイクロRNAレベル、機能、および関連する標的遺伝子を評価するためのインビトロプロトコル
Summary
このプロトコルは、プローブベースのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、スルフォルホダミンB(SRB)アッセイ、3’未翻訳領域(3’UTR)クローニング、および目的のmiRNAの標的遺伝子を検証し、miRNAの機能を理解するためにルシフェラーゼアッセイを使用します。
Abstract
マイクロRNA(miRNA)は、癌を含むいくつかの疾患において多数の細胞内シグナル伝達経路を調節することが認識されている小さな調節RNAです。これらの小さな調節RNAは、主に標的メッセンジャーRNA(mRNA)の3’非翻訳領域(3’UTR)と相互作用し、最終的にはmRNAの復号プロセスの阻害および標的mRNA分解の増強をもたらす。発現レベルおよび細胞内機能に基づいて、miRNAは発癌性および腫瘍抑制性mRNAの調節因子として機能することができる。計算的に予測された数百または数千の標的の中でmiRNAのボナフィード標的遺伝子を同定することは、目的とするmiRNAの役割と基本的な分子機構を識別するための重要なステップです。可能なmiRNA-mRNA相互作用を検索するために、様々なmiRNA標的予測プログラムが利用可能です。しかし、最も困難な問題は、目的とするmiRNAの直接標的遺伝子を検証する方法です。このプロトコルは、miRNAの機能に関連するmiRNA標的を同定する方法に関する主要な方法の再現可能な戦略を説明する。このプロトコルは、プローブベースのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、スルフォルホダミンB(SRB)アッセイを用いてmiRNAレベル、機能、および関連する標的mRNAを明らかにするステップバイステップの手順に関する実用的なガイドを提示します。、用量応答曲線生成、およびルシフェラーゼアッセイは、個々のmiRNAの役割を適切に理解するために必要な遺伝子の3’UTRのクローニングと共に。
Introduction
マイクロRNA(miRNA)は、主にボナフィード標的遺伝子1の3’非翻訳領域(3’UTR)に反応することにより、メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳および分解のプロセスを調節する小さな調節RNAです。miRNAの発現は、転写および転写後のメカニズムによって調節することができる。このような調節機構の不均衡は、癌2を含む多数の疾患において制御不能で特徴的なmiRNA発現レベルをもたらす。単一のmiRNAは、多様なmRNAとの複数の相互作用を持つことができます。それに応じて、個々のmRNAは様々なmiRNAによって制御することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ネットワークは、生理的障害および疾患が開始され、悪化することができる特徴的に発現したmiRNAによって複雑に影響され、2、3、4、5,6.miRNAの発現の変化は様々な種類の癌で観察されているが、miRNAと共に癌細胞のマナーを調節する分子機構は依然としてほとんど知られていない。
蓄積された証拠は、miRNAの発癌または腫瘍抑制の役割が癌の種類に依存することを示している。例えば、フォークヘッドボックスo3(FOXO3)を標的とすることにより、miR-155は、大腸癌7、8の細胞増殖、転移、および化学耐性を促進する。対照的に、神経膠腫細胞侵襲の制限は、神経原性遺伝子座ノッチホモログタンパク質2(NOTCH2)発現9の調節を介してmiR-107によって誘導される。miRNA機能に関連するmiRNA標的相互作用の評価は、miRNAが健康な状態と病気状態の両方で様々な生物学的プロセスを調節する方法をよりよく理解するために不可欠な部分です 10.さらに、miRNAのボナ・フィデス・ターゲットの発見は、様々な抗癌剤を用いてmiRNAベースの治療に対する微調整された戦略をさらに提供することができる。しかし、miRNAの分野における主な課題は、miRNAの直接標的の同定です。ここで、miRNA標的遺伝子決定に対する再現可能な実験的アプローチとして詳細な方法を提示する。miRNA標的同定のための実験設計の成功には、様々なステップと考慮事項が含まれます(図1)。腫瘍細胞および正常細胞における成熟したmiRNAレベルの比較は、目的のmiRNAを選択する一般的な手順の1つでありうっていう(図1A)。細胞増殖に対するmiRNAの効果を検出するために選択されたmiRNAの機能的研究は、目的とするmiRNAの最良の候補標的のリストを絞り込む必要がある(図1B)。miRNAの実験的に検証された機能に基づいて、miRNA標的予測プログラムを用いた文献とデータベースの系統的レビューが、遺伝子機能に関する最も関連性の高い情報を検索する必要がある(図1C)。目的とするmiRNAの実際の標的遺伝子の同定は、遺伝子の3’UTRのクローニング、リアルタイムPCR、およびウェスタンブロッティング(図1D)と共にルシフェラーゼアッセイなどの実験を実施することによって達成することができる。現在のプロトコルの目的は、主要な実験の包括的な方法を提供することです, プローブベースのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (PCR), スルフォルホダミンB (SRB) アッセイは、miRNA模倣トランスフェクションに続く, 用量応答曲線生成,遺伝子の3’UTRのクローニングと共にルシフェラーゼアッセイ。現在のプロトコルは、個々のmiRNAの機能と癌治療におけるmiRNAの意味をより良く理解するのに役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNAの複数の役割を理解するためには、関心のあるmiRNAの機能を有するボナ・フィドmiRNA標的の決定のための戦略が不可欠である。miRNA標的遺伝子の同定は、細胞内のmiRNAによって調節された細胞シグナル伝達事象を解釈するためのガイドラインでありうる。miRNAの機能的に重要な標的遺伝子の発表は、がんにおけるmiRNAベースの治療法を開発するための基礎知識を提供することができます。
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、文部科学省の助成を受けた韓国国立研究財団(NRF)を通じて基礎科学研究プログラム(2017R1D1A3B03035662)の支援を受けた。とハリム大学研究基金, 2017 (HRF-201703-003).
Materials
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6X DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8X Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
References
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