Summary

Indice competitivo basado en PCR digital para el análisis de alta producción de la aptitud en Salmonella

Published: May 13, 2019
doi:

Summary

Este enfoque molecular para determinar la aptitud bacteriana facilita la detección precisa y precisa de microorganismos utilizando códigos de barras de ADN genómicos únicos que se cuantifican a través de PCR digital. El protocolo describe el cálculo del índice competitivo para las cepas de Salmonella; sin embargo, la tecnología es fácilmente adaptable a los protocolos que requieren la cuantificación absoluta de cualquier organismo genéticamente maleable.

Abstract

Un índice competitivo es un método común utilizado para evaluar la aptitud bacteriana y/o la virulencia. La utilidad de este enfoque se ejemplifica por su facilidad de ejecución y su capacidad para estandarizar la aptitud de muchas cepas a un organismo de tipo salvaje. La técnica está limitada, sin embargo, por los marcadores fenotípicos disponibles y el número de cepas que se pueden evaluar simultáneamente, creando la necesidad de un gran número de experimentos de réplica. Simultáneamente con un gran número de experimentos, los costos de mano de obra y materiales para cuantificar bacterias basadas en marcadores fenotípicos no son insignificantes. Para superar estos aspectos negativos conservando los aspectos positivos, hemos desarrollado un enfoque molecular para cuantificar directamente los microorganismos después de diseñar marcadores genéticos en cromosomas bacterianos. Se insertaron códigos de barras de ADN únicos de 25 pares base en un locus inocuo en el cromosoma de cepas mutantes y de tipo salvaje de Salmonella. Los experimentos de competencia in vitro se realizaron utilizando inocula consistente en cepas agrupadas. Tras la competición, los números absolutos de cada cepa se cuantificaron utilizando PCR digital y los índices competitivos para cada cepa se calcularon a partir de esos valores. Nuestros datos indican que este enfoque para cuantificar la Salmonella es extremadamente sensible, preciso y preciso para detectar microorganismos altamente abundantes (alta aptitud) y raros (baja aptitud). Además, esta técnica es fácilmente adaptable a casi cualquier organismo con cromosomas capaces de modificar, así como a diversos diseños experimentales que requieren la cuantificación absoluta de microorganismos.

Introduction

Evaluar la aptitud y la virulencia de los organismos patógenos es un aspecto fundamental de la investigación en microbiología. Permite realizar comparaciones entre cepas o entre organismos mutados, lo que permite a los investigadores determinar la importancia de ciertos genes en condiciones específicas. Tradicionalmente, la evaluación de la virulencia utiliza un modelo animal de infección utilizando diferentes cepas bacterianas y observando el resultado del animal infectado (por ejemplo, Dosis Infecciosa50, Dosis letal50,tiempo hasta la muerte, gravedad de los síntomas, falta de síntomas, etc.). Este procedimiento proporciona descripciones valiosas de la virulencia, pero requiere que las cepas causen diferencias considerables en los resultados para detectar variaciones de tipo salvaje. Además, los resultados son semicuantitativos porque mientras que la progresión de la enfermedad y la gravedad de los síntomas se pueden cuantificar subjetivamente con el tiempo, la interpretación de la virulencia en comparación con el tipo salvaje es más cualitativa (es decir, más, menos o igualmente virulenta). Una alternativa común a la realización de ensayos de infectividad animal es generar índices competitivos (CIs), valores que comparan directamente la aptitud o virulencia de una cepa con una contraparte de tipo salvaje en una infección mixta1. Esta técnica tiene numerosas ventajas sobre un modelo animal tradicional de infección al estandarizar la virulencia a una cepa de tipo salvaje y determinar un valor cuantificable para reflejar el grado de atenuación. Esta técnica también se puede adaptar para analizar las interacciones genéticas en las bacterias mediante la determinación de un índice competitivo cancelado (COI)2. El cálculo de un COI para un grupo de organismos mutados permite a los investigadores determinar si dos genes contribuyen de forma independiente a la patogénesis o si están implicados en la misma vía de virulencia y dependen entre sí. Además, el cálculo de un CI requiere la enumeración de bacterias que pueden proporcionar información valiosa sobre la patogénesis de los organismos. Los COI y los COI también permiten a los investigadores assimilar a cepas avirulentas que no causan enfermedades clínicas pero que todavía tienen diferencias en la aptitud física. Esta técnica está limitada por el uso de marcadores tradicionales de resistencia a antibióticos para identificar cepas, limitando así el número de cepas de entrada a sólo una o dos a la vez. Debido a esta limitación, se requiere un gran número de grupos experimentales y réplicas, que además de aumentar los costos de mano de obra y materiales, también aumenta las oportunidades de variabilidad en condiciones experimentales y resultados inexactos. (Para una revisión exhaustiva de los beneficios y aplicaciones del uso de infecciones mixtas para estudiar la virulencia, la aptitud y las interacciones genéticas, véase C.R. Beuzón y D.W. Holden 1)

Se ha intentado superar esta limitación, como el uso de células etiquetadas fluorescentes cuantificadas a través de la citometría de flujo3,4,5. Esta técnica cuantifica las células utilizando 1) anticuerpos etiquetados para marcadores fenotípicos o 2) proteínas fluorescentes producidas endógenamente. El uso de anticuerpos etiquetados tiene un límite de detección de 1.000 células/ml, y por lo tanto requiere un alto número de células para analizar3. Las células que expresan proteínas fluorescentes tienen una fisiología alterada y son susceptibles a cambios de aptitud resultantes de la alta expresión proteica6. Ambos métodos están limitados por el número de marcadores fluorescentes detectables mediante citometría de flujo. Se logró un avance en la cuantificación molecular mediante el desarrollo de una técnica de microarray que detectó la atenuación en 120 cepas a partir de una infección mixta inicial de más de 1.000 cepas en un modelo murino7. Esta técnica utilizó un análisis de microarray de ARN a partir de cepas mutadas, lo que condujo a una considerable variabilidad en el resultado.  Sin embargo, estableció que grandes grupos de infecciones mixtas pueden ser una herramienta útil y que mediante la utilización de técnicas de detección sensibles, se pueden identificar diferencias en la virulencia bacteriana. Con el desarrollo de la secuenciación de próxima generación, Tn-seq amplió la utilidad de las mutaciones transposon, permitiendo un poderoso método para cuantificar bacterias que fueron mutadas aleatoriamente8,9,10, 11. Recientemente se desarrolló un protocolo alternativo que elimina la necesidad de transposones y en su lugar utiliza códigos de barras de ADN para identificar y realizar un seguimiento más fácil de los cambios genómicos y su impacto en la aptitud12. Esta tecnología es un avance importante, pero la inserción de los códigos de barras genómicos sigue siendo un proceso aleatorio. Para superar la aleatoriedad de experimentos anteriores, Yoon y otros desarrollaron un método para calcular los CI de las cepas de Salmonella utilizando códigos de barras de ADN únicos insertados en ubicaciones precisas en los cromosomas de la bacteria13. Se detectaron cepas únicas de códigos de barras utilizando un método basado en qPCR con verde SYBR y imprimaciones específicas para cada código de barras único. La técnica se vio limitada por las restricciones impuestas por qPCR, incluidas las diferencias en la eficiencia de imprimación y la baja sensibilidad, evidenciadas por la necesidad de PCR anidado antes de qPCR. Sin embargo, este enfoque demostró que las modificaciones genómicas específicas podían ser explotadas para detectar y potencialmente cuantificar los grupos de múltiples cepas bacterianas.

En el siguiente protocolo, describimos una metodología novedosa para realizar experimentos de competencia bacteriana con grandes piscinas de inóculas mixtas seguidas de una cuantificación precisa utilizando una técnica de PCR digital altamente sensible. El protocolo implica cepas bacterianas de etiquetado genética con un código de barras de ADN único insertado en una región inocua del cromosoma. Esta modificación permite cuantificar las cepas de forma rápida y precisa utilizando tecnología molecular moderna en lugar de diluciones seriales tradicionales, replicación y conteo de unidades formadoras de colonias que se basan en marcadores fenotípicos (es decir, resistencia a los antibióticos ). Las modificaciones permiten la evaluación simultánea de muchas cepas en un solo inóculo agrupado, reduciendo sustancialmente la posibilidad de variabilidad experimental porque todas las cepas están expuestas a las mismas condiciones exactas. Además, si bien esta técnica fue desarrollada en Salmonella enterica serovar Typhimurium, es altamente adaptable a cualquier organismo genéticamente maleable y casi cualquier diseño experimental donde se requieran recuentos bacterianos precisos, proporcionando un nuevo para aumentar la precisión y el rendimiento en los laboratorios de microbiología sin las restricciones impuestas por métodos anteriores.

Protocol

1. Incorporar códigos de barras de ADN únicos en un plásmido que contiene los componentes necesarios para el intercambio alélico NOTA: Se creó un nuevo plásmido, denominado pSKAP, con un alto número de copia y una mayor eficiencia de transformación en comparación con el plásmido de intercambio alómico pKD13 existente. Esto se describe en los pasos 1.1-1.12 (Figura1). Los plásmidos finalizados que contienen códigos de barras de ADN únic…

Representative Results

El uso de esta metodología requiere que se realicen las reacciones de control adecuadas para validar la sensibilidad y especificidad de cada sonda utilizada para identificar el ADN objetivo. En este experimento representativo, validamos ocho códigos de barras de ADN únicos con las ocho sondas correspondientes para su identificación. Las ocho sondas tenían una baja tasa de falsos positivos tanto en NTC como en reacciones de control negativas (Tabla3),destacando su esp…

Discussion

La capacidad de cuantificar con precisión los microorganismos es de suma importancia para la investigación de microbiología, y la capacidad de enumerar cepas únicas de una población mixta inicial ha demostrado ser una herramienta invaluable para evaluar los rasgos de aptitud y virulencia en gérmenes. Sin embargo, las técnicas para lograrlo no han progresado en el ritmo de los desarrollos modernos en biología molecular. La tecnología para modificar fácilmente los cromosomas de muchas bacterias, incluyendo S….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Fondo de Investigación de la Facultad del Presidente George F. Haddix y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el número de premio GM103427. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 22600028 Procure from any manufacturer
16 mL culture tubes MidSci 8599 Procure from any manufacturer
5-200 μL pipette tips RAININ 30389241 Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality
5-50 μL multichannel pipette RAININ 17013804 Use alternative multichannel pipettes with caution
Agarose ThermoFisher Scientific BP160-500 Procure from any manufacturer
BLAST Analysis NCBI N/A https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module Bio Rad 1851197 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Chemically competent DH5α Invitrogen 18258012 Procure from any manufacturer or prepare yourself
Chloramphenicol ThermoFisher Scientific BP904-100 Procure from any manufacturer
Cytation5 Microplate reader BioTek CYT5MF Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) Bio Rad N/A Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR 96-Well Plates Bio Rad 12001925 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Droplet Reader Oil Bio Rad 1863004 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Bio Rad 1863024 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1864008 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1863009 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Droplet Generation Oil for Probes Bio Rad 1863005 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Kanamycin ThermoFisher Scientific BP906-5 Procure from any manufacturer
Luria-Bertani agar ThermoFisher Scientific BP1425-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl
Luria-Bertani broth ThermoFisher Scientific BP1426-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable Bio Rad 1814040 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
PCR Tubes Eppendorf 951010022 Procure from any manufacturer
Petri dishes ThermoFisher Scientific FB0875712 Procure from any manufacturer
pPCR Script Cam SK+ Stratagene/Agilent 211192 No longer available commercially
Primer/Probe Design IDT N/A https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP and pSKAP_Barcodes Addgene Plasmid numbers 122702-122726 www.addgene.org
PX1 PCR Plate Sealer Bio Rad 1814000 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Generator Bio Rad 1864002 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Reader Bio Rad 1864003 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
S. Typhimurium strain ATCC 14028s ATCC ATCC 14028s www.atcc.org
Take3 Micro-Volume Plate BioTek TAKE3 Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Thermo Scientific FastDigest BamHI ThermoFisher Scientific FERFD0054 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest DpnI ThermoFisher Scientific FERFD1704 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest HindIII ThermoFisher Scientific FERFD0504 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit ThermoFisher Scientific FERK0832 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit ThermoFisher Scientific FERK0503 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F534L Procure from any manufacturer
Thermo Scientific T4 DNA Ligase ThermoFisher Scientific FEREL0011 Procure from any manufacturer
Thermocycler Bio Rad 1861096 Procure from any manufacturer
UVP Visi-Blue Transilluminator ThermoFisher Scientific UV95043301 Or other transiluminator that allows visualization of DNA
Water, Molecular Biology Grade ThermoFisher Scientific BP28191 Procure from any manufacturer

References

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Cite This Article
Shaw, J. A., Bourret, T. J. Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella. J. Vis. Exp. (147), e59630, doi:10.3791/59630 (2019).

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