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Summary
Abstract
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면역학 및 감염병학

Teste in vitro ELISA para avaliar a potência da vacina antirrábica

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/59641
,
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus,Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

Aqui descrevemos uma imunocaptura indireta do sanduíche ELISA para determinar o conteúdo de glicoproteína imunogênica em vacinas antirrábicas. Este teste usa um anticorpo monoclonal neutralizante (mAb-D1) reconhecendo aparadores de glicoproteína. É uma alternativa ao teste in vivo NIH para acompanhar a consistência da potência vacinal durante a produção.

Abstract

A crescente preocupação global com o bem-estar animal está incentivando os fabricantes e os Laboratórios Nacionais de Controle (OMCLs) a seguir a estratégia do 3Rs para a substituição, redução e refinamento dos testes em animais de laboratório. O desenvolvimento de abordagens in vitro é recomendado nos níveis da OMS e da Europa como alternativas ao teste do NIH para avaliar a potência da vacina antirrábica. Na superfície da partícula do vírus da raiva (RABV), os aparadores de glicoproteína constituem o maior imunogênio para induzir anticorpos neutralizantes virais (VNAbs). Um teste ELISA, onde os anticorpos monoclonais neutralizantes (mAb-D1) reconhecem a forma trimérica da glicoproteína, foi desenvolvido para determinar o conteúdo da glicoproteína trimérica dobrada nativa, juntamente com a produção dos lotes da vacina. Este teste de potência in vitro demonstrou uma boa concordância com o teste do NIH e foi encontrado adequado em ensaios colaborativos por fabricantes de vacinas RABV e OMCLs. Evitar o uso de animais é um objetivo alcançável em um futuro próximo.

O método apresentado baseia-se em uma imunocaptura indireta do sanduíche ELISA utilizando o mAb-D1 que reconhece os sítios antigênicos III (aa 330 a 338) da glicoproteína rabv trimérico, ou seja, o antígeno rabv imunogênico. mAb-D1 é usado tanto para revestimento quanto para detecção de aparadores de glicoproteína presentes no lote da vacina. Uma vez que o epítopo é reconhecido por causa de suas propriedades conformacionais, a glicoproteína potencialmente desnaturada (menos imunogênica) não pode ser capturada e detectada pelo mAb-D1. A vacina a ser testada é incubada em uma placa sensibilizada com o mAb-D1. As glicoproteínas rabv triméricas atadas são identificadas adicionando novamente o mAb-D1, rotulado com peroxidase e depois revelado na presença de substrato e cromógeno. A comparação da absorvância medida para a vacina testada e da vacina de referência permite determinar o teor de glicoproteína imunogênica.

Introduction

Há mais de 50 anos, o teste NIH1 é usado como método padrão-ouro para avaliar a potência da vacina antirrábica antes da liberação do lote. Este teste consiste em uma imunização intraperitoneal de grupos de camundongos com a vacina a ser testada seguida de um desafio intra-cerebral (IC) 14 dias depois com a cepa Challenge Virus Standard (CVS) do vírus da raiva (RABV). A potência é avaliada a partir da proporção de camundongos que sobreviveram ao desafio do IC. Embora a OMS2 ea Farmacopéia 3 ainda exijam o teste do NIH para avaliar a potência da vacina, este teste sofre vários obstáculos: os resultados são altamente variáveis4; O RABV infeccioso é utilizado durante o desafio e isso requer habilidade técnica e medidas rigorosas de biossegurança; um grande número de animais é utilizado, e a gravidade do desafio levanta sérias preocupações éticas5. Uma variação menos severa deste teste foi desenvolvida: duas semanas após a imunização intra-peritoneal, os camundongos não são desafiados pelo IC, mas sangraram e foram testados para a presença de anticorpos neutralizantes RABV específicos (VNAbs) em seu soro usando um teste de neutralização in vitro. No entanto, este teste ainda requer sacrificar um grande número de ratos de laboratório, embora já esteja em uso para as vacinas veterinárias6,7 e tenha sido considerado para vacinas humanas8.

A partir de agora, tanto as recomendações internacionais9 quanto aseuropeias 10 incentivam os fabricantes e os Laboratórios Nacionais de Controle de Medicamentos (Laboratórios Oficiais de Controle de Medicamentos – OMCLs) a implementar a Substituição, Redução e Refinamento de testes em animais de laboratório, referida como a estratégia 3Rs. A Diretiva Europeia 2010/63/UE (em vigor desde 2013/01/01) relacionada à proteção e bem-estar dos animais também reforçou as restrições para os fabricantes de vacinas e laboratórios envolvidos no Controle de Qualidade das vacinas antirrábicas, bem como na pesquisa antirrábica11. Como resultado, o desenvolvimento, a validação e o uso de abordagens alternativas in vitro tornaram-se agora uma prioridade. Estes não são apenas eticamente sólidos, mas também podem reduzir os custos de teste em lote e reduzir o tempo para os resultados para horas em vez de semanas3.

Na superfície da partícula RABV, a glicoproteína adota uma forma trimérica12,,13,14,,15,16. Na vacina antirrábica, esta forma trimérica nativa constitui o maior imunogênio indutor de VNAbs17, enquanto as glicoproteínas monoméricas, solúveis ou desnaturadas são mal imunogênicas18,19. Assim, a preservação dos aparadores da glicoproteína ao longo do processo de produção da vacina é um bom indicador para a preservação de um potencial imunogênico ideal. Vários métodos imunoquímicos, tais como o anticorpo-binding-test20,21, o teste de imunodifusão radial única (SRD)22 e o teste ELISA23,24,25,26,27 sãorecomendados pelo Relatório Técnico da OMS Série2 e a monografia europeia3 para quantificar o teor de antígeno nas vacinas antigen raes. Estes são utilizados pelos fabricantes para monitorar a consistência da produção de vacinas e pela OMCL para avaliar a formulação consistente de lotes de vacinas humanas28, mesmo que o teste do NIH ainda seja considerado para a potência.

No entanto, todos esses métodos imunoquímicos não são equivalentes. O teste SRD requer um pré-tratamento que pode alterar os aparadores ancorados na membrana e resultar em uma forma solúvel ou desnaturada da glicoproteína22,29. Portanto, o SRD não é muito eficiente em discriminar as glicoproteínas imunogênicas e não imunogênicas, resultando em uma avaliação imperfeita da imunogenicidade de um lote vacinal. Em contraste, o teste ELISA é mais sensível22, preserva a estrutura nativa da glicoproteína, e é mais apropriado para determinar o conteúdo dos aparadores nativamente dobrados de glicoproteína. O teste ELISA pode usar anticorpos antiglicoicos monoclonais de coelho ou de camundongos purificados ou concentrados com sulfato de amônio. Estudos demonstraram boa concordância entre o teste do NIH e o teor de antígeno avaliado pela ELISA nas vacinas e concluíram que os métodos ELISA são adequados para o teste de potência in vitro. Isso defende que os testes ELISA podem pelo menos complementar ou mesmo substituir o teste NIH4,,26,27,30,,31,32,33. Hoje, a Farmacopoeia europeia recomenda o uso de ensaios sorológicos ou imunoquímicos validados como alternativas ao teste DO NIH3. A completa evitação do uso animal para a potência da vacina tornou-se uma perspectiva realista.

O método apresentado abaixo baseia-se em uma imunocaptura indireta do sanduíche ELISA usando um clone de anticorpo monoclonal de rato (mAb-D1) que reconhece os sítios antigênicos III (aa 330 a 338) da glicoproteína rabv trimeric15,34. Este método foi desenvolvido inicialmente no laboratório Institut Pasteur26,30 depois otimizado e validado pela Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), ou seja, o Francês OMCL4,33. O mAb-D1 é usado tanto para sensibilizar a placa quanto posteriormente para detectar o antígeno capturado. Isso permite a quantificação específica dos aparadores de glicoproteína, ou seja, o antígeno rabv imunogênico. O mAb-D1 utilizado para a detecção é rotulado com peroxidase, o que é revelado na presença do substrato e do cromógeno. A comparação da absorvância medida para a vacina testada e da vacina de referência permite determinar o teor de glicoproteína imunogênica. Note-se que o mesmo tipo de ensaio pode ser aplicado para diferentes mAbs reconhecendo diferentes locais antigênicos da glicoproteína RABV35. O método para obter e purificar ou concentrar-se com sulfato de amônio antiglicoproteína poliglobulinas de coelho g (IgG) ou globulinas de camundongos monoclonais foram extensivamente descritos anteriormente36 juntamente com o método para conjugar anticorpos com peroxidase37.

Protocol

1. Precauções de segurança NOTA: Este método é aplicável tanto ao RABV vivo quanto à vacina inativada. Use bons procedimentos de prática e segurança laboratorial. Use equipamentos de proteção individual adequados (EPI) incluindo casaco descartável, luvas, máscara, óculos, etc. Quando o vírus vivo for titulado, use um gabinete de segurança biológica classe II. Considere qualquer material em contato com as amostras (reagentes, soluções de …

Representative Results

No exemplo a seguir, é utilizada a vacina de referência Lote 09, composta por partículas purificadas do vírus da raiva inativada (cepa de vacina FOTO), é utilizada. O teor de aparadores de glicoproteína (10 μg/mL) foi estabelecido após a determinação da quantidade total de proteínas virais (teste BCA) e avaliação da porcentagem da glicoproteína por eletroforese em gel de poliacrilamida. Alternativamente, pode-se utilizar uma vacina de referência calibrada, por exemplo, a<su…

Discussion

O epítopo reconhecido pelo mAb-D1 está localizado no sítio antigênico III da glicoproteína RABV que não só é imuno-dominante para a indução de VNAbs, mas também envolvido em neurovibramento, patogenicidade40,,41 e reconhecimento de receptorescaneamento 42. Há outro importante local antigênico ao longo da glicoproteína, o local II43, contra o qual vários MAbs foram isolados, como o mAb-WI-1112<sup clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Sylvie Morgeaux e Dr. Jean-Michel Chapsal devem ser reconhecidos por sua participação fundamental para estabelecer o ensaio ELISA em lotes de vacinas e organizar workshops internacionais e estudos colaborativos. Agradecemos a Sabrina Kali pela leitura crítica do manuscrito. O Dr. Pierre Perrin foi responsável pelo isolamento e caracterização do mAb-D1. Este trabalho tem sido apoiado principalmente pelo financiamento do Institut Pasteur.

Materials

Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880
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Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).
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