Les changements morphologiques se produisent dans les cellules de fibroblaste sensibles au système immunitaire après l’activation et favorisent des changements dans le recrutement cellulaire. Utilisation de l’imagerie à 2 photons en conjonction avec une protéine génétiquement modifiée spécifique au fibroblaste 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) ligne de souris et vert fluorescent marqué lipopolysaccharide-FITC, nous pouvons illustrer l’apport très spécifique de lipopolysaccharide dans les fibroblastes dermiques et les changements morphologiques in vivo.
Les fibroblastes sont des cellules mésenchymales qui modifient leur morphologie lors de l’activation, influençant finalement le microenvironnement du tissu dans lequel ils se trouvent. Bien que les techniques d’imagerie traditionnelles soient utiles pour identifier les interactions et la morphologie des protéines dans les tissus fixes, elles ne sont pas en mesure de donner un aperçu de la rapidité avec laquelle les cellules sont capables de se lier et d’adopter des protéines, et une fois activées comment leur morphologie change Vivo. Dans la présente étude, nous posons 2 questions majeures : 1) quel est le cours temporel de l’activation du fibroblaste par le biais d’interactions entre les récepteurs 4 (TLR4) et le lipopolysaccharide (LPS) et 2) comment ces cellules se comportent-elles une fois activées? À l’aide de l’imagerie à 2 photons, nous avons mis au point une nouvelle technique pour évaluer la capacité du LPS-FITC à se lier à son récepteur cognate, TLR4, exprimé sur les fibroblastes périphériques dans la ligne de souris de journaliste génétique; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox in vivo. Cette approche unique permet aux chercheurs de créer des vidéos en temps mort en profondeur et/ou des images de protéines interagissant avec des cellules vivantes, ce qui permet d’avoir un niveau accru de granularité pour comprendre comment les protéines peuvent modifier le comportement cellulaire.
Le lipopolysaccharide (LPS) est une endotoxine présente dans la membrane externe des bactéries gramnégatives1. LPS a une affinité de liaison élevée pour le récepteur à péage 4 (TLR4)/CD14/MD2 complexe de récepteurs2. TLR4 est un récepteur de reconnaissance de modèle généralement trouvé sur la membrane externe d’un large éventail de cellules immunitaires, de cellules mésenchymales, et d’un sous-ensemble de neurones sensoriels3,4,5. L’activation de TLR4 exprimée sur les cellules immunitaires mène aux systèmes de deuxième messager MyD88-dépendants et indépendants, se terminant par la translocation de kappa bêta de facteur nucléaire (NF-B) au noyau de la cellule. Cela provoque la cellule immunitaire prototypique de produire et de libérer des cytokines pro-inflammatoires tels que l’interleukine (IL)-1, IL-6, et TNF-6 . Cependant, la façon dont d’autres types de cellules réagissent à la stimulation TLR4 n’est pas aussi claire. Les fibroblastes ont été impliqués dans un large éventail de pathologies telles que les cancers et la fibrose kystique et ont récemment été montrés pour jouer un rôle monocyte chimio-attraction et la promotion de l’inflammation7,8,9. Notre laboratoire s’intéresse au rôle des fibroblastes dans le développement de la douleur aigue et chronique, car les premières preuves suggèrent que les facteurs libérés par les fibroblastes (métallinases matricielles (MMP), inhibiteur tissulaire des métalloprotéinases (TIMP) et fibroblaste facteurs de croissance (FGF)) sont impliqués dans la douleur neuropathique10.
Les états d’activation des cellules peuvent être déterminés par une variété de facteurs qui incluent : l’induction des gènes immédiats-tôt, l’expression altérée de protéine, la prolifération de cellules, et les changements morphologiques11,12,13. Il existe de nombreuses techniques pour répondre aux questions que nous pouvons avoir sur la façon dont l’activation des cellules contribue aux pathologies, mais ils ont tous leurs limites. L’immunohistochimie prototypique utilise des anticorps étiquetés fluorescents pour étiqueter les protéines d’intérêt dans les tissus fixes, qui peuvent être non spécifiques et nécessitent souvent un dépannage important avant de produire des résultats fructueux14. Le ballonnement occidental est une technique utile en comparant des niveaux d’expression de protéine dans le tissu post-mortem ; cependant, la composante histologique fait défaut dans cette technique et les chercheurs sont incapables d’identifier les changements dans la morphologie15. RNA-Seq nous permet de quantifier la présence d’ARN messager dans un échantillon qui, dans de nombreux cas, donne des données perspicaces; cependant, l’écart entre la transcription et la traduction rend difficile d’avoir une résolution temporelle après un stimulus16. L’imagerie confocale est utile pour déterminer l’expression et la co-localisation des protéines qui existent dans une section transversale des tissus17. Souvent, ce n’est pas représentatif de l’ensemble de l’échantillon de tissu. En revanche, les microscopes multiphotons permettent aux utilisateurs d’imager environ 1 mm de profondeur dans un échantillon, créant une représentation tridimensionnelle complète18. Par conséquent, nous choisissons de nous concentrer sur les préparations d’imagerie invivo, 2 photons, car les données recueillies à partir de ces expériences sont plus directement relatables au microenvironnement hautement plastique et interconnecté des tissus vivants.
Un avantage d’étudier les interactions protéine-récepteur in vivo est que nous pouvons clairement capturer comment les cellules réagissent à un stimulus, en temps réel, dans leur environnement indigène sans l’influence nocive et imprévisible de l’extraction des tissus post-mortem19. En outre, des études longitudinales peuvent être effectuées pour évaluer la plasticité cellulaire et l’amorçage qui peuvent se produire en raison de l’activation. À l’aide de l’imagerie à 2 photons, nous préservons l’intégrité du microenvironnement présent lorsqu’un stimulus externe est appliqué. Ce protocole fournit un moyen d’identifier l’apport de molécules dans les fibroblastes après l’injection périphérique de LPS étiquetés fluorescents au cours de plusieurs heures in vivo et le rôle de TLR4 dans l’activation du fibroblaste.
On peut dire que les étapes les plus importantes de l’imagerie in vivo à 2 photons sont : 1) Choisir la souris de journaliste génétique et la protéine fluorescente pour la configuration multiphoton et les besoins expérimentaux21,22; 2) l’imagerie du plan focal correct pour avoir une représentation précise de la population de cellules dans le tissu23; 3) minimiser le mouvement dû à un animal mal immobilisé24;</s…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est soutenu par la subvention NS096030 (MDB). Nous tenons également à remercier le directeur du noyau d’imagerie Ved Prakash. Nous tenons également à remercier Olympus Discovery Center/Imaging Core installation à l’UT Dallas pour fournir de l’équipement et du soutien
10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 – FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |