In Vivo Deux-Couleur 2-Photon Imagerie des cellules de reporter génétiquement marqués dans la peau
Summary
Les changements morphologiques se produisent dans les cellules de fibroblaste sensibles au système immunitaire après l’activation et favorisent des changements dans le recrutement cellulaire. Utilisation de l’imagerie à 2 photons en conjonction avec une protéine génétiquement modifiée spécifique au fibroblaste 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) ligne de souris et vert fluorescent marqué lipopolysaccharide-FITC, nous pouvons illustrer l’apport très spécifique de lipopolysaccharide dans les fibroblastes dermiques et les changements morphologiques in vivo.
Abstract
Les fibroblastes sont des cellules mésenchymales qui modifient leur morphologie lors de l’activation, influençant finalement le microenvironnement du tissu dans lequel ils se trouvent. Bien que les techniques d’imagerie traditionnelles soient utiles pour identifier les interactions et la morphologie des protéines dans les tissus fixes, elles ne sont pas en mesure de donner un aperçu de la rapidité avec laquelle les cellules sont capables de se lier et d’adopter des protéines, et une fois activées comment leur morphologie change Vivo. Dans la présente étude, nous posons 2 questions majeures : 1) quel est le cours temporel de l’activation du fibroblaste par le biais d’interactions entre les récepteurs 4 (TLR4) et le lipopolysaccharide (LPS) et 2) comment ces cellules se comportent-elles une fois activées? À l’aide de l’imagerie à 2 photons, nous avons mis au point une nouvelle technique pour évaluer la capacité du LPS-FITC à se lier à son récepteur cognate, TLR4, exprimé sur les fibroblastes périphériques dans la ligne de souris de journaliste génétique; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox in vivo. Cette approche unique permet aux chercheurs de créer des vidéos en temps mort en profondeur et/ou des images de protéines interagissant avec des cellules vivantes, ce qui permet d’avoir un niveau accru de granularité pour comprendre comment les protéines peuvent modifier le comportement cellulaire.
Introduction
Le lipopolysaccharide (LPS) est une endotoxine présente dans la membrane externe des bactéries gramnégatives1. LPS a une affinité de liaison élevée pour le récepteur à péage 4 (TLR4)/CD14/MD2 complexe de récepteurs2. TLR4 est un récepteur de reconnaissance de modèle généralement trouvé sur la membrane externe d’un large éventail de cellules immunitaires, de cellules mésenchymales, et d’un sous-ensemble de neurones sensoriels3,4,5. L’activation de TLR4 exprimée sur les cellules immunitaires mène aux systèmes de deuxième messager MyD88-dépendants et indépendants, se terminant par la translocation de kappa bêta de facteur nucléaire (NF-B) au noyau de la cellule. Cela provoque la cellule immunitaire prototypique de produire et de libérer des cytokines pro-inflammatoires tels que l’interleukine (IL)-1, IL-6, et TNF-6 . Cependant, la façon dont d’autres types de cellules réagissent à la stimulation TLR4 n’est pas aussi claire. Les fibroblastes ont été impliqués dans un large éventail de pathologies telles que les cancers et la fibrose kystique et ont récemment été montrés pour jouer un rôle monocyte chimio-attraction et la promotion de l’inflammation7,8,9. Notre laboratoire s’intéresse au rôle des fibroblastes dans le développement de la douleur aigue et chronique, car les premières preuves suggèrent que les facteurs libérés par les fibroblastes (métallinases matricielles (MMP), inhibiteur tissulaire des métalloprotéinases (TIMP) et fibroblaste facteurs de croissance (FGF)) sont impliqués dans la douleur neuropathique10.
Les états d’activation des cellules peuvent être déterminés par une variété de facteurs qui incluent : l’induction des gènes immédiats-tôt, l’expression altérée de protéine, la prolifération de cellules, et les changements morphologiques11,12,13. Il existe de nombreuses techniques pour répondre aux questions que nous pouvons avoir sur la façon dont l’activation des cellules contribue aux pathologies, mais ils ont tous leurs limites. L’immunohistochimie prototypique utilise des anticorps étiquetés fluorescents pour étiqueter les protéines d’intérêt dans les tissus fixes, qui peuvent être non spécifiques et nécessitent souvent un dépannage important avant de produire des résultats fructueux14. Le ballonnement occidental est une technique utile en comparant des niveaux d’expression de protéine dans le tissu post-mortem ; cependant, la composante histologique fait défaut dans cette technique et les chercheurs sont incapables d’identifier les changements dans la morphologie15. RNA-Seq nous permet de quantifier la présence d’ARN messager dans un échantillon qui, dans de nombreux cas, donne des données perspicaces; cependant, l’écart entre la transcription et la traduction rend difficile d’avoir une résolution temporelle après un stimulus16. L’imagerie confocale est utile pour déterminer l’expression et la co-localisation des protéines qui existent dans une section transversale des tissus17. Souvent, ce n’est pas représentatif de l’ensemble de l’échantillon de tissu. En revanche, les microscopes multiphotons permettent aux utilisateurs d’imager environ 1 mm de profondeur dans un échantillon, créant une représentation tridimensionnelle complète18. Par conséquent, nous choisissons de nous concentrer sur les préparations d’imagerie invivo, 2 photons, car les données recueillies à partir de ces expériences sont plus directement relatables au microenvironnement hautement plastique et interconnecté des tissus vivants.
Un avantage d’étudier les interactions protéine-récepteur in vivo est que nous pouvons clairement capturer comment les cellules réagissent à un stimulus, en temps réel, dans leur environnement indigène sans l’influence nocive et imprévisible de l’extraction des tissus post-mortem19. En outre, des études longitudinales peuvent être effectuées pour évaluer la plasticité cellulaire et l’amorçage qui peuvent se produire en raison de l’activation. À l’aide de l’imagerie à 2 photons, nous préservons l’intégrité du microenvironnement présent lorsqu’un stimulus externe est appliqué. Ce protocole fournit un moyen d’identifier l’apport de molécules dans les fibroblastes après l’injection périphérique de LPS étiquetés fluorescents au cours de plusieurs heures in vivo et le rôle de TLR4 dans l’activation du fibroblaste.
Protocol
Representative Results
Discussion
On peut dire que les étapes les plus importantes de l’imagerie in vivo à 2 photons sont : 1) Choisir la souris de journaliste génétique et la protéine fluorescente pour la configuration multiphoton et les besoins expérimentaux21,22; 2) l’imagerie du plan focal correct pour avoir une représentation précise de la population de cellules dans le tissu23; 3) minimiser le mouvement dû à un animal mal immobilisé24;</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par la subvention NS096030 (MDB). Nous tenons également à remercier le directeur du noyau d’imagerie Ved Prakash. Nous tenons également à remercier Olympus Discovery Center/Imaging Core installation à l’UT Dallas pour fournir de l’équipement et du soutien
Materials
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 – FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
References
- Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
- Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), 356-369 (2017).
- Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
- Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
- Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).
- Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
- Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
- Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
- Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
- Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, 85-91 (2004).
- Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
- Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
- Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
- Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
- Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
- Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184 (2015).
- Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).
