In vivo to-farvet 2-foton billeddannelse af genetisk mærkede reporter celler i huden
Summary
Morfologiske ændringer forekommer i immun responderende fibroblast celler efter aktivering og fremme ændringer i cellulære rekruttering. Udnyttelse af 2-photon Imaging i forbindelse med en genetisk manipuleret fibroblast-specifikke protein 1 (FSP1)-CRE; tdtomato floxed-stop-floxed (TB/TB) muse linje og grøn fluorescently Tagged LPS-FITC, vi kan illustrere meget specifik optagelse af lipopolysaccharid i Dermal fibroblaster og morfologiske ændringer in vivo.
Abstract
Fibroblaster er mesenchymal celler, der ændrer deres morfologi ved aktivering, i sidste ende påvirker mikromiljøet i det væv, de er placeret i. Selv om traditionelle billeddannelsesteknikker er nyttige til at identificere protein interaktioner og morfologi i fast væv, er de ikke i stand til at give indsigt i, hvor hurtigt cellerne er i stand til at binde og optagelsen proteiner, og når de er aktiveret, hvordan deres morfologi ændringer i In vivo. I nærværende undersøgelse stiller vi 2 store spørgsmål: 1) Hvad er tidsforløbet af fibroblast aktivering via Toll-lignende receptor-4 (TLR4) og lipopolysaccharid (LPS) interaktion og 2) hvordan opfører disse celler sig, når de er aktiveret? Ved hjælp af 2-photon Imaging, har vi udviklet en ny teknik til at vurdere muligheden for LPS-FITC at binde til sin cognate receptor, TLR4, udtrykt på perifere fibroblaster i den genetiske reporter muse linje; FSP1cre; tdTomatoLOX-stop-LOX in vivo. Denne unikke tilgang giver forskerne mulighed for at skabe dybdegående, time-lapse videoer og/eller billeder af proteiner interagere med levende celler, der giver mulighed for at have en øget detaljeringsgrad i forståelsen af, hvordan proteiner kan ændre cellulære adfærd.
Introduction
Lipopolysaccharid (LPS) er et endotoksin, der findes i den ydre membran af gram-negative bakterier1. LPS har en høj bindingsaffinitet til den bompenge lignende receptor 4 (TLR4)/CD14/MD2 receptor Complex2. TLR4 er en mønster anerkendelse receptor almindeligt forekommende på den ydre membran af en bred vifte af immunceller, mesenchymal celler, og en delmængde af sensoriske neuroner3,4,5. Aktivering af TLR4 udtrykt på immunceller fører til MyD88-afhængige og uafhængige anden Messenger-systemer, slutter med nuklear-faktor Kappa Beta (NFκB) translokation til kernen i cellen. Dette får prototypic immun cellen til at producere og frigive pro-inflammatoriske cytokiner såsom interleukin (IL) -1 β, IL-6, og TNF-α6. Men, hvordan andre celle-typer reagerer på TLR4 stimulation er ikke så klar. Fibroblaster har været impliceret i en bred vifte af patologier såsom kræft og cystisk fibrose og har for nylig vist sig at spille en rolle monocyt Chemo-tiltrækning og fremme betændelse7,8,9. Vores laboratorium er interesseret i rollen som fibroblaster i udviklingen af akutte og kroniske smerter, som tidlige beviser tyder på, at faktorer frigivet af fibroblaster (matrix metalloproteinaser (MMPs), vævs hæmmer af metalloproteinaser (TIMPs), og fibroblast vækstfaktorer (FGFs)) er involveret i neuropatiske smerter10.
Aktiverings tilstande af celler kan bestemmes af en række faktorer, der omfatter: induktion af umiddelbare tidlige gener, ændret protein udtryk, celle proliferation og morfologiske ændringer11,12,13. Der er mange teknikker, der findes til at besvare spørgsmål, vi måtte have om, hvordan aktivering af celler bidrager til patologier, men de har alle deres begrænsninger. Prototypical immunhistochemistry bruger fluorescently mærkede antistoffer til at mærke proteiner af interesse i fast væv, som kan være uspecifik og ofte kræver betydelig fejlfinding, før giver frugtbare resultater14. Western blotting er en nyttig teknik, når man sammenligner niveauer af protein ekspression i post mortem-væv; men den histologiske komponent mangler i denne teknik, og forskerne er ude af stand til at identificere eventuelle ændringer i morfologi15. RNA-SEQ tillader os at kvantificere tilstedeværelsen af Messenger RNA i en prøve, som i mange tilfælde giver indsigtsfulde data; men kløften mellem transkriptionen og oversættelsen gør det vanskeligt at have tidsmæssig opløsning efter en stimulus16. Confocal Imaging er nyttigt til at bestemme ekspression og samlokalisering af proteiner, der findes i et tværsnit af væv17. Ofte er dette ikke repræsentativt for hele vævsprøven. I modsætning hertil giver multiphoton mikroskoper brugerne mulighed for at billede omkring 1 mm dybt ind i en prøve, hvilket skaber en omfattende tredimensionel repræsentation18. Derfor vælger vi at fokusere på in vivo, 2-photon Imaging Preps, da data indsamlet fra disse eksperimenter er mere direkte relatable til den meget plastik og indbyrdes forbundne mikromiljø af levende væv.
En fordel ved at studere protein-receptor interaktioner in vivo er, at vi klart kan fange, hvordan cellerne reagerer på en stimulus, real-time, i deres indfødte miljø uden den skadelige og uforudsigelige indflydelse af post mortem-vævs ekstraktion19. Derudover kan longitudinale undersøgelser udføres for at vurdere cellulær plasticitet og priming, der kan opstå på grund af aktivering. Ved hjælp af 2-photon Imaging bevarer vi integriteten af det mikromiljø, der er til stede, når der anvendes en ekstern stimulus. Denne protokol giver en måde at identificere optagelsen af molekyler i fibroblaster efter perifer injektion af fluorescently Tagged LPS i løbet af flere timer in vivo og rollen som TLR4 i fibroblast aktivering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formentlig de vigtigste trin i in vivo 2-photon Imaging er: 1) at vælge den rigtige genetiske reporter mus og fluorescently-mærkede protein til multi-foton setup og eksperimentelle behov21,22; 2) Imaging den korrekte fokal plan for at have en nøjagtig repræsentation af populationen af celler i vævet23; 3) minimering af bevægelse på grund af et uretmæssigt immobiliseret dyr24; og 4) vælge, hvornår data skal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde understøttes af Grant NS096030 (MDB). Vi vil også gerne takke billedbehandlings Core Manager ved Prakash. Vi vil også gerne takke Olympus Discovery Center/Imaging Core Facility hos UT Dallas for at levere udstyr og support
Materials
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 – FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
References
- Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
- Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), 356-369 (2017).
- Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
- Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
- Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).
- Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
- Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
- Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
- Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
- Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, 85-91 (2004).
- Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
- Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
- Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
- Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
- Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
- Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184 (2015).
- Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).
