In vivo tvåfärgad 2-Photon Imaging av genetiskt märkta reporter celler i huden
Summary
Morfologiska förändringar sker i immun responsiva fibroblastceller efter aktivering och främja förändringar i cellulära rekrytering. Använda 2-Photon Imaging i samband med en genetiskt modifierade fibroblast-specifika protein 1 (FSP1)-CRE; tdTomato floxed-Stop-floxed (TB/TB) mus linje och grön Fluorescent taggade lipopolysackarid-FITC, vi kan illustrera mycket specifik upptag av lipopolysackarid i dermal fibroblaster och morfologiska förändringar in vivo.
Abstract
Fibroblaster är mesenkymala celler som ändrar sin morfologi vid aktivering, i slutändan påverkar mikromiljön i vävnaden de är placerade i. Även om traditionella avbildningstekniker är användbara för att identifiera proteininteraktioner och morfologi i fast vävnad, de kan inte ge insikt om hur snabbt celler kan binda och upptag proteiner, och en gång aktiverat hur deras morfologi förändringar i Vivo. I den nuvarande studien, frågar vi 2 stora frågor: 1) Vad är tiden-loppet av fibroblast aktivering via Toll-liknande receptor-4 (TLR4) och lipopolysackarid (LPS) interaktion och 2) hur dessa celler beter sig när aktiverad? Med hjälp av 2-Photon Imaging, har vi utvecklat en ny teknik för att bedöma förmågan hos LPS-FITC att binda till sin besläktat receptor, TLR4, uttryckt på perifera fibroblaster i den genetiska reporter mus linjen; FSP1cre; tdTomatoLOX-stopp-LOX in vivo. Detta unika tillvägagångssätt gör det möjligt för forskare att skapa djupgående, tidsfördröjd video och/eller bilder av proteiner som interagerar med levande celler som gör att man kan ha en ökad nivå av granularitet i förståelsen av hur proteiner förändrar cellernas beteende.
Introduction
Lipopolysackarid (LPS) är ett endotoxin som finns i det yttre membranet av gramnegativa bakterier1. LPS har en hög bindningsaffinitet för den avgiftsbelagda receptor 4 (TLR4)/CD14/MD2 receptor Complex2. TLR4 är ett mönsterigenkänning receptor vanligt förekommande på det yttre membranet i ett brett spektrum av immunceller, mesenkymala celler, och en delmängd av sensoriska nervceller3,4,5. Aktivering av TLR4 uttrycks på immunceller leder till MyD88-beroende och oberoende andra Messenger-system, slutar med nukleär faktor kappa beta (nfκb) flyttning till kärnan av cellen. Detta orsakar vänlighet immunceller att producera och släppa pro-inflammatoriska cytokiner såsom interleukin (Il) -1 β, IL-6, och TNF-α6. Hur andra celltyper reagerar på TLR4 stimulering är dock inte lika tydlig. Fibroblaster har varit inblandade i ett brett spektrum av patologier såsom cancer och cystisk fibros och har nyligen visat sig spela en roll monocyt chemo-attraktion och främja inflammation7,8,9. Vårt labb är intresserad av rollen av fibroblaster i utvecklingen av akut och kronisk smärta, som tidiga belägg tyder på att faktorer som frigörs genom fibroblaster (Matrix metalloproteinaser (MMPs), vävnads hämmare av metalloproteinaser (TIMPs), och fibroblast tillväxtfaktorer (FGFs)) är involverade i neuropatisk smärta10.
Aktiveringstillstånd av celler kan bestämmas av en mängd faktorer som inkluderar: induktion av omedelbara tidiga gener, förändrat proteinuttryck, cellproliferation, och morfologiska förändringar11,12,13. Det finns många tekniker som finns för att besvara frågor vi kan ha om hur aktivering av celler bidrar till patologier, men de har alla sina begränsningar. Prototypiska immunohistokemi använder fluorescerande märkta antikroppar för att märka proteiner av intresse för fast vävnad, som kan vara ospecifik och ofta kräver betydande felsökning innan ger fruktbara resultat14. Western blotting är en användbar teknik när man jämför nivåer av proteinuttryck i post-mortem vävnad; den histologiska komponenten saknas dock i denna teknik och forskarna kan inte identifiera några förändringar i morfologin15. RNA-SEQ tillåter oss att kvantifiera närvaron av Messenger-RNA i ett prov som i många fall ger insiktsfulla data; men klyftan mellan transkription och översättning gör det svårt att ha temporala upplösning efter en stimulans16. Konfokal avbildning är användbart vid bestämning av uttryck och samlokalisering av proteiner som finns i ett tvärsnitt av vävnader17. Ofta är detta inte representativt för hela vävnadsprovet. Multifotonmikroskop gör det däremot möjligt för användare att avbilda ungefär 1 mm djupt in i ett prov, vilket skapar en omfattande tredimensionell representation18. Därför väljer vi att fokusera på in vivo, 2-Photon Imaging Preps, som data som samlats in från dessa experiment är mer direkt relatable till mycket plast och sammankopplade mikromiljö av levande vävnad.
En fördel med att studera protein receptor interaktioner in vivo är att vi tydligt kan fånga hur celler reagerar på en stimulans, realtid, i sin egen miljö utan den skadliga och oförutsägbara påverkan av post-mortem vävnad utvinning19. Dessutom kan longitudinella studier utföras för att bedöma cellulär plasticitet och priming som kan uppstå på grund av aktivering. Med hjälp av 2-Photon Imaging, bevarar vi integriteten i den mikromiljö som finns när en extern stimulans tillämpas. Detta protokoll ger ett sätt att identifiera upptaget av molekyler i fibroblaster efter perifer injektion av Fluorescent märkta LP-skivor under loppet av flera timmar in vivo och rollen av TLR4 i fibroblast aktivering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förmodligen de viktigaste stegen i in vivo 2-Photon Imaging är: 1) att välja rätt genetisk reporter mus och fluorescently-märkta protein för multi-Photon setup och experimentella behov21,22; 2) avbildning av rätt fokalplan för att få en korrekt representation av populationen av celler i vävnaden23; 3) minimera rörelse på grund av ett felaktigt immobiliserat djur24; och 4) välja när data ska analyseras …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Grant NS096030 (MDB). Vi skulle också vilja tacka Imaging Core Manager ved Prakash. Vi skulle också vilja tacka Olympus Discovery Center/Imaging Core facility på UT Dallas för att tillhandahålla utrustning och support
Materials
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 – FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
References
- Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
- Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), 356-369 (2017).
- Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
- Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
- Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).
- Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
- Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
- Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
- Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
- Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, 85-91 (2004).
- Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
- Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
- Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
- Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
- Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
- Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184 (2015).
- Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).
