Expressão rápida e eficiente de múltiplas proteínas em embriões aviários usando o mRNA Electroporation
Summary
Nós relatamos o electroporation do RNA do mensageiro (mRNA) como um método que permita a expressão rápida e eficiente de proteínas múltiplas no sistema do modelo do embrião de codorniz. Este método pode ser usado para cDNAs etiquetar pilhas e gravar seus movimentos in vivo pela microscopia do tempo-lapso logo após o electroporation.
Abstract
Nós relatamos que o electroporation de mRNA permite proteínas fluorescentes etiquetar pilhas em embriões de codorniz vivos mais rapidamente e amplamente do que o electroporation do ADN. A eficiência elevada do transfection permite pelo menos 4 mRNAs distintos ser co-transfected com eficiência do ~ 87%. A maioria dos mRNAs em é degradada durante os primeiros 2 h borne-Electroporation, permitindo que os experimentos tempo-sensíveis sejam realizados no embrião tornando-se. Finalmente, nós descrevemos como dinamicamente imagem embriões vivos em com os mRNAs que codificam várias proteínas fluorescentes alvejadas subcellular.
Introduction
O electroporation é um método físico do transfection que use um pulso elétrico para criar pores transientes na membrana de plasma, permitindo que as substâncias como ácidos nucleicos ou produtos químicos passem no cytosol. O electroporation é amplamente utilizado para entregar o ADN nas bactérias, no fermento, nas plantas, e nas pilhas mamíferos1,2,3. É rotineiramente usado para introduzir cargas genéticas em células-alvo e tecidos dentro do embrião aviário em desenvolvimento para estudar o controle genético do desenvolvimento ou rotular populações migratórias de células4,5,6, o 7. Entretanto, várias limitações experimentais também existem com a eletroporação do DNA8. Por exemplo, o electroporation do ADN introduz frequentemente números altamente variáveis de vetores da expressão por a pilha e subseqüentemente o mRNAs e as proteínas que codificam. Essa variabilidade pode levar a uma considerável heterogeneidade celular que complica tanto a análise de imagem quanto a interpretação dos dados9,10. Adicionalmente, as proteínas do Electroporation do ADN começam somente expressar ~ 3 h borne-Electroporation e não alcangam a eficiência máxima no número de pilha e na intensidade da fluorescência até 12 h, provável devido ao tempo exigido para transferir no núcleo e terminar transcrição e tradução in vivo11.
Em contraste, o transfection de mRNA foi usado eficazmente em uma variedade de sistemas modelo, incluindo oócitos de Xenopus laevis pelo microinjection12,13, reprogramando pilhas de haste humanas pelo transfection 14 do Lipofectamine do mRNA , e electroporating pilhas de haste neural recalcitrantes em ratos adultos15. Nós testamos a habilidade do Electroporation do mRNA para etiquetar eficientemente pilhas durante o desenvolvimento embrionário aviário adiantado usando in vitro os mRNAs sintetizados que codificam proteínas fluorescentes distintas (FPs). Para nossos estudos, utilizamos o vetor pCS2 +, um vetor de expressão multiuso que é comumente usado para expressar proteínas em embriões de Xenopus e zebrafish. Os promotores da polimerase do RNA SP6 e T7 no pCS2 + permitem a síntese de mRNA e proteína de qualquer gene clonado quando utilizado em um sistema de transcrição/tradução in vitro.
Aqui, Nós demonstramos que o electroporation de mRNA permite a expressão rápida e eficiente de proteínas fluorescentes (FPs) em embriões gastrulating da codorniz. Nós projetamos e gerou muitos dos vetores de expressão utilizados nesses estudos. Por exemplo, subclonamos o gene LifeAct-eGFP16 para o pCS2 + vector17 para expressar do promotor CMV e promotor SP6. O gene introduzido encontra-se a jusante do promotor SP6 e a montante da cauda de SV40 Poly (A)18. Nos embriões co-electroporated com mRNA e ADN, os FPs codificados de mRNAs transcritos in vitro foram detectados primeiramente dentro de 20 minutos do Electroporation, visto que os FPs dos vetores da expressão do ADN foram detectados somente após 3 h. codificação múltipla de mRNAs para nuclear, Golgi, e as proteínas da membrana podem ser em em um embrião simultaneamente, tendo por resultado a expressão rápida e eficiente de proteínas múltiplas em pilhas individuais. Finalmente, usando uma recuperação in vivo da fluorescência após o ensaio do photobranqueamento (Frap), nós mostramos que uma maioria da deterioração em dos mRNAs dentro de 2 h. Assim, a produção inicial rápida da proteína combinada com a tradução nova limitada da proteína faz a Electroporation do mRNA uma técnica valiosa quando o controle temporal da expressão é necessário.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, nós fornecemos instruções passo a passo sobre como precisamente microinjetar e electroporate mRNA nas células de embriões de codorniz gastrulating. Demonstramos que a eletroporação de mRNA sintetizada in vitro permite expressão rápida e eficiente de proteínas fluorescentes (FPs) em embriões gastrulantes de codorniz (Figura 2 e 3). A fluorescência da proteína H2B-citrina traduzida de mRNAs em podia ser detectada pela microscopia confocal dentro d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a David Huss por insights úteis sobre este trabalho. Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação de pesquisa de Verão de Rose Hills Foundation (2016-2018) e bolsista de pesquisa de graduação da USC Provost para a MT, o prêmio de pré-doutorado de treinamento intramural da Saban Research Institute para M.D., e a Universidade de Prêmio do programa de iniciação científica do Sul da Califórnia à R.L.
Materials
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
| SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
| SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
| Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
| pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
| pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
| pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
| pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
| pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
| Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
| CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
| Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
| Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
| XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
| 1.37 M NaCl | |||
| 27 mM KCl | |||
| 80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
| PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use. | ||
| 1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
| 0.1% Triton X-100 |
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