هنا، نقدم مجهرية القوة الذرية (AFM)، تعمل كأداة المسافات البادئة نانو والدقيقة على الخلايا والأنسجة. تسمح الأداة بالحصول في وقت واحد على طوبوغرافيا سطح 3D للعينة وخصائصها الميكانيكية، بما في ذلك معامل جدار الخلية يونغ، فضلا عن ضغط التورغور.
نقدم هنا استخدام مجهرية القوة الذرية لأنسجة النبات المسافة البادئة واستعادة خصائصه الميكانيكية. باستخدام اثنين من المجاهر المختلفة في وضع المسافة البادئة، ونحن نعرض كيفية قياس معامل مرنة واستخدامها لتقييم خصائص جدار الخلية الميكانيكية. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن أيضا شرح كيفية تقييم ضغط التورغور. المزايا الرئيسية للميكروسكوب القوة الذرية هي أنه غير الغازية، سريع نسبيا (5 ~ 20 دقيقة)، وأنه يمكن تحليل أي نوع تقريبا من الأنسجة النباتية الحية التي هي مسطحة سطحيا دون الحاجة إلى العلاج. القرار يمكن أن تكون جيدة جدا، اعتمادا على حجم طرف وعلى عدد القياسات لكل منطقة وحدة. أحد قيود هذا الأسلوب هو أنه يعطي فقط الوصول المباشر إلى طبقة الخلية السطحية.
ينتمي الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) إلى عائلة الفحص المجهري للمسبار المسحي (SPM)، حيث يقوم طرف بنصف قطر يبلغ عادة بضعة نانومترات بمسح سطح العينة. لا يتم الكشف عن سطح عن طريق الأساليب البصرية أو المستندة إلى الإلكترون، ولكن عن طريق قوى التفاعل بين الطرف وسطح العينة. وبالتالي، فإن هذه التقنية لا تقتصر على التوصيف الطبوغرافي لسطح العينة (دقة ثلاثية الأبعاد يمكن أن تنخفض إلى بضعة نانومترات)، بل تسمح أيضا بقياس أي نوع من قوى التفاعل مثل الكهروستاتيكي، فان دير والز أو قوى الاتصال. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الطرف لتطبيق القوى على سطح عينة بيولوجية وقياس التشوه الناتج، ما يسمى “المسافة البادئة”، من أجل تحديد خصائصه الميكانيكية (على سبيل المثال، معامل يونغ، خصائص لزجة).
الخصائص الميكانيكية لجدران الخلايا النباتية ضرورية يجب أخذها فيالاعتبار عند محاولة فهم الآليات الكامنة وراء العمليات التنموية 1،2،3. في الواقع، يتم التحكم في هذه الخصائص بإحكام أثناء التنمية، لا سيما منذ تليين جدار الخلية مطلوب للسماح للخلايا بالنمو. يمكن استخدام AFM لقياس هذه الخصائص ودراسة الطريقة التي تتغير بين الأعضاء والأنسجة أو مراحل النمو.
في هذه الورقة، ونحن نصف كيف نستخدم AFM لقياس كل من خصائص جدار الخلية الميكانيكية والضغط turgor. يتم عرض هذين الطلبين على اثنين من المجاهر AFM مختلفة ومفصلة هنا بعد.
يتم تحديد ظهور الأشكال في النباتات بشكل رئيسي من خلال معدل منسق واتجاه النمو خلال الزمان والمكان. يتم تغليف الخلايا النباتية في جدار خلية جامدة مصنوعة من مصفوفة polysaccharidic، الذي يلصق لهم معا. ونتيجة لذلك، يتم التحكم في توسيع الخلية من خلال التوازن بين ضغط التورغور سحب على جدار الخلية، وصلاب?…
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نشكر فريق بلاتيم على دعمه التقني، وكذلك أريزكي بودووأعضاء فريق الفيزياء الحيوية في مختبر RDP لإجراء مناقشات مفيدة.
Growth medium | |||
1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
Tools for AFM | |||
BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
Patafix | UHU | D1620 | |
Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |