Uso de la Microscopía de Fuerza Atómica para Medir las Propiedades Mecánicas y la Presión Turgor de Células Vegetales y Tejidos Vegetales
Summary
Aquí, presentamos la microscopía de fuerza atómica (AFM), operada como una herramienta de nano- y micro-indentación en células y tejidos. El instrumento permite la adquisición simultánea de la topografía de superficie 3D de la muestra y sus propiedades mecánicas, incluyendo el módulo de Young de la pared celular, así como la presión del turgencia.
Abstract
Aquí presentamos el uso de la microscopía de fuerza atómica para destetar los tejidos vegetales y recuperar sus propiedades mecánicas. Usando dos microscopios diferentes en modo de sangría, mostramos cómo medir un módulo elástico y usarlo para evaluar las propiedades mecánicas de la pared celular. Además, también explicamos cómo evaluar la presión del turgor. Las principales ventajas de la microscopía de fuerza atómica son que no es invasiva, relativamente rápida (5-20 min), y que prácticamente cualquier tipo de tejido vegetal vivo que es superficialmente plano se puede analizar sin necesidad de tratamiento. La resolución puede ser muy buena, dependiendo del tamaño de la punta y del número de medidas por unidad de área. Una limitación de este método es que sólo da acceso directo a la capa de celda superficial.
Introduction
La microscopía de fuerza atómica (AFM) pertenece a la familia de microscopía de sonda de exploración (SPM), donde una punta con un radio de unos pocos nanómetros escanea la superficie de una muestra. La detección de una superficie no se logra a través de métodos ópticos o basados en electrones, sino a través de las fuerzas de interacción entre la punta y la superficie de la muestra. Por lo tanto, esta técnica no se limita a la caracterización topográfica de una superficie de muestra (resolución 3D que puede bajar a unos pocos nanómetros), sino que también permite la medición de cualquier tipo de fuerzas de interacción como electrostática, van der Waals o fuerzas de contacto. Además, la punta se puede utilizar para aplicar fuerzas en la superficie de una muestra biológica y medir la deformación resultante, la llamada “indentación”, con el fin de determinar sus propiedades mecánicas (por ejemplo, módulo de Young, propiedades viscoelásticas).
Las propiedades mecánicas de las paredes celulares de la planta son esenciales a tener en cuenta a la hora de tratar de comprender los mecanismos subyacentes a los procesos de desarrollo1,2,3. De hecho, estas propiedades se controlan estrechamente durante el desarrollo, en particular porque se requiere un ablandamiento de la pared celular para permitir que las células crezcan. AFM se puede utilizar para medir estas propiedades y estudiar la forma en que cambian entre órganos, tejidos o etapas del desarrollo.
En este artículo, describimos cómo usamos AFM para medir las propiedades mecánicas de la pared celular y la presión del turgencia. Estas dos aplicaciones se demuestran en dos microscopios AFM diferentes y se detallan aquí después.
Protocol
Representative Results
Discussion
La aparición de formas en las plantas está determinada principalmente por la tasa coordinada y la dirección del crecimiento durante el tiempo y el espacio. Las células vegetales están encerradas en una pared rígida de células hecha de una matriz polisacárdica, que las pega. Como resultado, la expansión celular se controla mediante el equilibrio entre la presión del turgencia tirando de la pared celular, y la rigidez de la pared celular resistiéndose a esta presión. Con el fin de entender los mecanismos subyac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al equipo de PLATIM por su apoyo técnico, así como a Arezki Boudaoud y a los miembros del equipo de Biophysic en el laboratorio rdp por sus útiles debates.
Materials
| Growth medium | |||
| 1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
- Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
- Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants?. Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
- Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
- Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
- Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. Chapter 11 – In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
- Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
- Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152 (2017).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
- Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
- Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
- Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
- Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
