Burada, hücre ve dokularda nano ve mikro girinti aracı olarak işletilen atomik kuvvet mikroskobu (AFM) sunuyoruz. Cihaz, numunenin 3D yüzey topografisini ve hücre duvarı Young ‘ın modüllerinin yanı sıra Turgor basıncını da içeren mekanik özelliklerini eşzamanlı olarak satın almayı sağlar.
Burada atom kuvveti mikroskobu kullanımı bitki dokularına girinti ve mekanik özelliklerini kurtarmak için sunuyoruz. Girintileme modunda iki farklı mikroskopları kullanarak, bir elastik modülün nasıl ölçüleceği ve hücre duvarının mekanik özelliklerini değerlendirmek için nasıl kullanılacağını gösteririz. Buna ek olarak, Turgor basıncını nasıl değerlendireceğiz de açıklanmaktadır. Atomik kuvvet mikroskopinin ana avantajları, non-invaziv, nispeten hızlı (5 ~ 20 dakika) ve yüzeysel olarak düz olan yaşam bitki dokusunun neredeyse her türlü tedaviye gerek kalmadan analiz edilebilir olmasıdır. Çözünürlük, uç boyutuna ve birim alanı başına ölçüm sayısına bağlı olarak çok iyi olabilir. Bu yöntemin bir sınırlama sadece yüzeysel hücre katmanına doğrudan erişim sağlar olmasıdır.
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tarama prob mikroskobu (SPM) ailesine aittir, genellikle birkaç nanometrelerin yarıçapı olan bir uç bir numunenin yüzeyini tarar. Bir yüzeyin tespiti, optik veya elektron bazlı yöntemlerle değil, uç ile örnek yüzey arasındaki etkileşim güçleri aracılığıyla elde edilmez. Böylece, bu teknik örnek bir yüzeyin topografik karakterizasyonu ile sınırlı değildir (birkaç nanometreye kadar gidebilir 3D çözünürlük), aynı zamanda elektrostatik, Van der Waals veya kontak kuvvetleri gibi etkileşim kuvvetlerinin her türlü ölçümünü sağlar. Ayrıca, uç biyolojik bir numunenin yüzeyine kuvvet uygulamak ve ortaya çıkan deformasyonu ölçmek için kullanılabilir, sözde “girinti”, mekanik özelliklerini belirlemek için (örneğin, Young ‘s modulus, viskoelastik özellikleri).
Bitki hücresi duvarlarının mekanik özellikleri, gelişim süreçlerinin temelindeki mekanizmaları anlamaya çalışırken dikkate alınması gerekli olan1,2,3. Nitekim, bu özellikleri sıkıca geliştirme sırasında kontrol edilir, hücre duvar yumuşatıcı hücrelerin büyümesine izin vermek için gerekli olduğundan özellikle. AFM, bu özellikleri ölçmek ve organlar, dokular veya gelişimsel aşamaları arasında değişme şeklini incelemek için kullanılabilir.
Bu yazıda, hem hücre duvarı mekanik özelliklerini hem de Turgor basıncını ölçmek için AFM ‘nin nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bu iki uygulama iki farklı AFM mikroskoplar üzerinde gösterilmiştir ve sonra burada ayrıntılı olarak gösterilmektedir.
Bitkilerin şekillerin ortaya çıkması esas olarak zaman ve uzay sırasında koordine oranı ve büyüme yönü ile belirlenir. Bitki hücreleri, onları bir araya yapıştıran bir polisakkaridik matrisden yapılmış sert bir hücre duvarında kaplı. Sonuç olarak, hücre genişleme hücre duvarı çekerek Turgor basıncı arasındaki denge tarafından kontrol edilir, ve bu basınca dayanıklı hücre duvarının sertlik. Kalkınma temel mekanizmaları anlamak için, farklı dokularda veya belirli bir organ hücrele…
The authors have nothing to disclose.
Biz kendi teknik destek için PLıM ekibi teşekkür etmek istiyorum, yanı sıra Arezki Boudaoud ve yararlı tartışmalar için RDP laboratuarında Biophysic ekibinin üyeleri.
Growth medium | |||
1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
Tools for AFM | |||
BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
Patafix | UHU | D1620 | |
Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |