Livraison d'anticorps dans le cerveau murine via la livraison convection-améliorée
Summary
L’accouchement par convection (CED) est une méthode permettant une livraison efficace des produits thérapeutiques dans le cerveau par perfusion directe de grands volumes de tissus. La procédure nécessite l’utilisation de cathéters et une procédure d’injection optimisée. Ce protocole décrit une méthodologie pour LED d’un anticorps dans un cerveau de souris.
Abstract
L’accouchement enrichi par convection (DEC) est une technique neurochirurgicale permettant une perfusion efficace de gros volumes cérébraux à l’aide d’un système de cathéter. Une telle approche fournit une méthode d’accouchement sûre en contournant la barrière hémato-encéphalique (BBB), permettant ainsi un traitement à l’aide d’une thérapie à faible perméabilité à la BBB ou pour laquelle l’exposition systémique n’est pas souhaitée, par exemple, en raison de la toxicité. Le CED nécessite l’optimisation de la conception du cathéter, du protocole d’injection et des propriétés de l’infusate. Avec ce protocole, nous décrivons comment effectuer LECE d’une solution contenant jusqu’à 20 g d’un anticorps dans le putamen caudate de souris. Il décrit la préparation des cathéters d’étape, les testant in vitro et exécutant le CED chez les souris utilisant un programme d’injection rampant. Le protocole peut être facilement ajusté pour d’autres volumes de perfusion et peut être utilisé pour injecter divers traceurs ou substances pharmacologiquement actives ou inactives, y compris les chimiothérapies, cytokines, particules virales et liposomes.
Introduction
La barrière hémato-encéphalique (BBB) forme une frontière semi-perméable séparant le système nerveux central (SNC) de la circulation sanguine. Atteindre le SNC avec des traitements est cependant nécessaire dans le contexte de diverses maladies, comme les tumeurs cérébrales, la maladie d’Alzheimer (MA) ou la maladie de Parkinson (PD) entre autres1. Cela devient important dans le développement de nouvelles thérapies, surtout si le médicament testé présente une faible perméabilité BBB ou son exposition systémique peut conduire à une toxicité dangereuse1,2. Certains des anticorps cliniquement utilisés affichent ces deux caractéristiques. Une solution à ce problème serait de livrer la thérapeutique directement derrière le BBB.
L’accouchement enrichi par convection (DEC) est une technique neurochirurgicale permettant une perfusion efficace de grands volumes cérébraux. Ceci est réalisé en installant chirurgicalement un ou plusieurs cathéters dans la zone cible. Pendant l’application de drogue, un gradient de pression est formé à l’ouverture du cathéter, qui devient la force motrice de la dispersion d’infusate dans le tissu3,4. C’est donc la durée de l’infusion et non les coefficients de diffusion qui déterminent la plage de perfusion2,4,5. Ceci fournit la livraison uniforme de l’infusate au-dessus d’un volume de cerveau beaucoup plus grand comparé aux méthodes conventionnelles, de diffusion basée d’injection intracérébrale2,6. Dans le même temps, cette modalité d’administration a un risque plus faible de lésions tissulaires2. En conséquence, LE DEC peut permettre l’administration sûre et efficace des chimiothérapeutiques conventionnels pour le traitement des tumeurs de CNS, aussi bien que la livraison des agents immunomodulateurs ou des anticorps agonistiques et antagonistes dans une multitude d’autres désordres de CNS2 ,7,8,9. CED est actuellement testé dans les thérapies de la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, ainsi que le gliome de haute qualité2,7,8,10,11.
La conception du cathéter et le régime d’injection sont parmi les facteurs les plus importants influençant le résultat de CED 10,12,13,14,15,16. En outre, il nécessite des propriétés physicochimiques spécifiques de l’infusate, y compris la taille modérée des particules, une charge anionique, et une faible affinité tissulaire 10,17. Chacun de ces paramètres doit être potentiellement ajusté en fonction des caractéristiques histologiques de la région du cerveau pour être ciblé2,10,17.
Ici nous décrivons la méthodologie pour exécuter CED d’une solution d’anticorps dans le putamen caudate (striatum) des souris. En outre, le protocole comprend la préparation de cathéters d’étape dans une configuration de laboratoire, les tester in vitro et effectuer le CED.
Il existe plusieurs conceptions de cathéter disponibles dans la littérature, différant par la forme de la canule, les matériaux utilisés et le nombre d’ouvertures de cathéter12,15,18,19,20 ,21,22. Nous utilisons un cathéter d’étape fait d’un capillaire de silice fusionné dépassant 1 mm d’une aiguille en métal d’extrémité émoussée. Cette conception de cathéter peut être facilement fabriquée dans un laboratoire de recherche et donne de façon reproductible de bons résultats DEC une fois examiné in vitro avec des blocs d’agarose avec des paramètres physiques ressemblant au parenchyme cérébral in vivo23.
De plus, nous mettons en œuvre un régime de rampe ment pour la livraison de 5 L d’infusate in vivo. Dans un tel protocole, le taux d’injection est augmenté de 0,2 L/min à un maximum de 0,8 L/min, minimisant ainsi les chances d’infuser le reflux le long du cathéter ainsi que le risque de lésions tissulaires16. En utilisant ce protocole, nous avons administré avec succès des souris avec jusqu’à 20 g d’anticorps dans 5 L de PBS au cours de 11 min 30 s.
Le protocole peut être facilement ajusté pour d’autres volumes de perfusion ou pour l’injection de diverses autres substances, par exemple chimiothérapeutiques, cytokines, particules virales ou liposomes2,10,14,18 ,22. En cas d’utilisation d’infusate avec des propriétés physicochimiques radicalement différentes par rapport à une solution de saline tamponnée de phosphate (PBS) ou de liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) d’anticorps, des étapes de validation supplémentaires sont recommandées. Pour l’assemblage, la validation et le CED du cathéter, nous décrivons toutes les étapes à l’aide d’un robot stéréotaxique avec une unité de forage et d’injection montée sur un cadre stéréotaxique régulier. Cette procédure peut également être effectuée avec un cadre stéréotaxique manuel relié à la pompe programmable de microinfusion qui peut conduire les microseringues en verre décrites.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’accouchement par convection, ou perfusion médicamenteuse sous pression dans le cerveau, a été proposé pour la première fois au début des années 19903. Cette approche promet la perfusion de gros volumes de cerveau derrière la barrière hémato-encéphalique d’une manière contrôlée2. Cependant, jusqu’à présent, seuls quelques essais cliniques ont été réalisés en utilisant cette approche, en partie parce que LE CED dans une configuration clinique s’est avér…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par des subventions de l’Université de Zurich (FK-15-057), de la Novartis Foundation for medical-biological Research (16C231) et de Swiss Cancer Research (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) à Johannes vom Berg et BRIDGE Proof of Concept (20B1-1 177300) à Linda Schellhammer.
Materials
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
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