Uma plataforma Microfluídico para estimular condrócitos com compressão dinâmica
Summary
Este artigo fornece métodos detalhados para fabricar e caracterizar um dispositivo microfluídicos de actuação pneumaticamente para a compressão do condrócitos.
Abstract
Estímulos mecânicos são conhecidos por modulam funções biológicas de células e tecidos. Estudos recentes sugerem que o estresse compressivo altera a arquitetura da cartilagem da placa de crescimento e resulta na modulação do crescimento de ossos longos de crianças. Para determinar o papel do stress compressivo no crescimento ósseo, criamos um dispositivo microfluídico acionado por pressão pneumática, para dinamicamente (ou estaticamente) comprimir condrócitos de placa de crescimento embutidos em cilindros de hidrogel de alginato. Neste artigo, descrevemos métodos detalhados para fabricar e caracterizar este dispositivo. As vantagens de nosso protocolo são: 1) cinco magnitudes diferentes do esforço compressivo podem ser gerados em cinco repetições técnicas em uma única plataforma, 2) é fácil visualizar a morfologia da pilha através de um microscópio de luz convencional, 3) as pilhas podem ràpida ser isoladas a partir do dispositivo após a compressão para facilitar os ensaios a jusante, e 4) a plataforma pode ser aplicada para estudar mecanobiologia de qualquer tipo de célula que pode crescer em hidrogéis.
Introduction
As plataformas micro-projetadas são ferramentas valiosas para estudar a biologia molecular, celular, e do nível de tecido porque permitem o controle dinâmico dos microambientes físicose químicos1,2,3 ,4,5,6,7,8. Assim, as hipóteses múltiplas podem simultaneamente ser testadas em uma maneira firmemente controlada. No caso da cartilagem da placa de crescimento, há evidências crescentes de um importante papel do estresse compressivo na modulação do crescimento ósseo através da ação sobre a cartilagem da placa de crescimento9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. No entanto, o mecanismo de ação do estresse compressivo – em particular, como o estresse orienta a formação de colunas de condrócitos na placa de crescimento – é pouco compreendido.
O objetivo deste protocolo é criar um dispositivo de compressão de condrócitos microfluídico de acionamento pneumaticamente26 para elucidar mecanismos de mecanobiologia em condrócitos de placa de crescimento (Figura 1a-c). O dispositivo consiste em duas porções: a unidade pneumática da atuação e a construção do gel do alginato. A unidade de acionamento pneumático microfluídico é fabricada com polidimetilsiloxano (PDMS) com base na foto e na Soft-litografia. Esta unidade contem uma disposição 5 x 5 de balões finos da membrana de PDMS que podem ser inflados diferentemente baseados em seus diâmetros. A construção do gel do alginato consiste nos condrócitos encaixados em uma disposição 5 x 5 de cilindros do gel do alginato, e os constructos inteiros do alginato-chondrocyte são montados com a unidade da atuação. As construções de gel de alginato são compactadas pelos balões PDMS inflacionados pneumaticamente (Figura 1b). O dispositivo microfluídico pode gerar cinco níveis diferentes de estresse compressivo simultaneamente em uma única plataforma baseada em diferenças no diâmetro do balão PDMS. Assim, um teste da elevado-taxa de transferência do mechanobiology do condrócitos circunstâncias múltiplas da compressão é possível.
O dispositivo microfluídico descrito neste protocolo tem muitas vantagens sobre o dispositivo de compressão convencional, tais como fixadores externos14,21,23 e dispositivos de compressão macroscópica16, 19 anos de , 27 anos de , 28 para estudar a mecanobiologia do condrócitos: 1) o dispositivo microfluídicos é cost-effective porque consome o volume menor das amostras do que o dispositivo macroscópico da compressão, 2) o dispositivo microfluídicos é tempo eficaz porque pode testar o múltiplo condições de compressão simultaneamente, 3) o dispositivo microfluídico pode combinar estímulos mecânicos e químicos, formando um gradiente de concentração de produtos químicos com base na mistura limitada em microcanais, e 4) várias técnicas de microscopia (lapso de tempo microscopia e microscopia confocal da fluorescência) podem ser aplicados com o dispositivo microfluídicos feito de PDMS transparente.
Adotou-se e modificou o método de Moraes et al.7,29 para criar diferentes níveis de estresse compressivo em um único dispositivo para possibilitar estudos de mecanobiologia de alta produtividade de compressão de condrócitos. Nossa aproximação é apropriada para pilhas (por exemplo, chondrocytes) que precisam o ambiente tridimensional (3D) da cultura e para ensaios biológicos após ter comprimindo pilhas. Embora alguns dispositivos de compressão celular microfluídico possam comprimir células cultivadas em substratos bidimensionais (2D)30,31,32, eles não podem ser usados para condrócitos porque os condrócitos cultivados em 2D desdiferenciam-se. Existem plataformas microfluídico para comprimir células 3D cultivadas em hidrogéis fotopolimerizados7,33, mas eles são limitados em isolar as células após experimentos de compressão porque isolar as células de fotopolimerizadas hidrogel não é fácil. Adicionalmente, os efeitos da exposição ultravioleta (UV) e dos iniciadores de reticulação da foto nas pilhas podem precisar de ser avaliados. Em contraste, nosso método permite o isolamento rápido de células após experimentos de compressão para ensaios pós-biológicos, pois os hidrogéis de alginato podem ser despolimerizados rapidamente por quelantes de cálcio. Os métodos detalhados da fabricação e da caracterização do dispositivo são descritos neste protocolo. Um breve procedimento para fabricar o dispositivo de compressão microfluídico de condrócitos é mostrado na Figura 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para testar os efeitos do estresse compressivo nos condrócitos da placa de crescimento, desenvolvemos o dispositivo de compressão microfluídico do condrócito (Figura 1) para aplicar vários níveis de estresse compressivo aos condrócitos no andaime de hidrogel de alginato para 3D cultura em formas de alta taxa de transferência. Para ajudar outros pesquisadores a adotar nosso dispositivo ou desenvolver dispositivos semelhantes, fornecemos detalhes das etapas de fabricação do dispositi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos Drs. Christopher Moraes e Stephen A. Morin por seu suporte para design e fabricação de dispositivos. Este estudo foi apoiado pela bioengenharia para subsídio de saúde humana da Universidade de Nebraska-Lincoln (UNL) e da Universidade de Nebraska Medical Center (UNMC), e Grant AR070242 da NIH/NIAMS. Agradecemos a Janice A. Taylor e James R. talaska, da central de microscopia avançada do centro médico da Universidade de Nebraska, por fornecer assistência com microscopia confocal.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
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