Method Article

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 번역 면역 종양학에 대한 인간화 제종이식 모델 (I-O) 연구

DOI:

10.3791/59679

⸱

August 15th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BeiGene (Beijing) Co., Ltd.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 기술합니다 - 번역형 면역 종양학 연구를 위한 기지를 둔 인간화한 이종이식 마우스 모형. 이 프로토콜은 I-O 치료 평가를 위한 유사한 모형을 설치하고 특성화하기 위한 일반적인 지침으로 봉사할 수 있었습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

최근 몇 년 동안 면역 종양학 (I-O) 치료의 발견과 개발은 암 치료의 이정표를 나타냅니다. 그러나, 치료 도전은 지속. 강력하고 질병과 관련된 동물 모델은 다양한 추가 적인 면역 체크포인트를 해결하기 위해 지속적인 전임상 연구 및 개발을 위한 중요한 자원입니다. 여기에서, 우리는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 기술합니다 - 기지를 둔 인간화한 이종이식 모형. BGB-A317(Tislelizumab)은 후기 임상 개발에서 인간화된 항PD-1 항체로 플랫폼 설정, 모델 특성화 및 약물 효능 평가를 논의하는 예로 사용됩니다. 이 인간화한 마우스는 시험된 대부분의 인간적인 종양의 성장을 지원합니다, 따라서 인간적인 면제 및 인간적인 암 둘 다의 맥락에서 I-O 치료의 평가를 허용하. 일단 확립되면, 우리의 모델은 비교적 시간과 비용 효율적이며, 일반적으로 매우 재현 가능한 결과를 산출한다. 우리는 이 문서에 설명된 프로토콜이 I-O 연구를 위한 인간 PBMC 및 종양으로 재구성된 마우스 모형을 설치를 위한 일반적인 지침으로 봉사할 수 있었다는 것을 건의합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

면역 종양학 (I-O)는 암 치료의 급속하게 확장하는 분야입니다. 연구원은 최근에 종양을 공격하는 면역 계통의 변조 기능의 치료 잠재력을 평가하기 시작했습니다. 면역체크포인트 봉쇄는 흑색종, 신장세포암, 두경부암, 폐암, 방광및 전립선암1,2를포함한 다양한 암 유형에서 고무적인 활동을 입증했다. 암세포를 직접 죽이는 표적 치료와는 달리, I-O 요법은 종양을 공격하기 위해신체의 면역 체계를 강력하게 합니다 3.

현재까지 수많은 관련 I-O 동물 모델이 설립되었습니다. 이들은: 1) 마우스 종양 세포주 또는 합성 마우스에서의 종양 동종 이식; 2) 유전자 조작 마우스 (GEM) 또는 발암 물질 유도로부터 유래 된 자발적 종양; 3) 기능성 뮤린 면역계에서 인간 약물 표적(들)의 노크인을 가진 키메라 GEM; 및 4) 인간 암세포 또는 환자 유래 이종이식(PDX)으로 이식된 재구성된 인간 면역을 가진 마우스. 이러한 각 모델은 명백한 장점뿐만 아니라 제한 사항이 있으며, 다른 곳에서 광범위하게 설명하고 검토한4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 참가자와 관련된 연구에서 수행된 모든 절차는 BeiGene 및/또는 국가 연구 위원회의 윤리 기준과 1964년 헬싱키 선언 및 그 이후의 개정 또는 비교 가능한 윤리 기준에 따라 수행되었습니다. 고지된 동의는 연구에 포함된 모든 개별 참가자로부터 얻어졌다. 동물과 관련된 연구에서 수행 된 모든 절차는 BeiGene의 내부 검토 위원회에 의해 승인되었습니다. 이 프로토콜은 인간화된 NOD/SCID 마우스에서 BGB-A317(Tislelizumab)의 평가를 위해 특별히 조정되었습니다.

1. 인간 PBMC 기반 모델 구축

  1. 사이클로포스파미드를 사용한 NOD/SCID 마우스의 골수성 절제술: 최적의 용량 결정
    1. 구매 여성 NOD/SCID 마우스 (6-8 주).
      참고: 이 연구에 참여한 모든 마우스는 여성이었다.
    2. 식염수에 다른 용량 (50, 100 및 150 mg/kg)에서 사이클로 포스파미드 (CP)를 준비하십시오. 125 mg/kg에서 식염수로 0.8% 트웬-80에 디설피람(DS)을 준비합니다.
      참고: CP의 상이한 농도는 CP의 상이한 복용량을 얻는 마우스에 동등한 양의 약물 용액의 투여를 가능하게 하....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 절차에 따라 PBMC 기반의 인간화 이종이식 모델이 성공적으로 확립되었습니다. 간단히 말해서, NOD/SCID 마우스에서의 CP 골수제 효과는 CP 및 DS 치료 후 호중구 및 단핵구집단의 유세포 분석 분석에 의해 결정되었다(도 1). 100 mg/kg CP 플러스 125 mg/kg DS 최적의 복용량으로 결정 하 고 처방으로 후면 연구에 사용 하 여 호중구와 단핵구의 최대 고갈 쥐에 심각한 독성을 유발 하지 않고. 다음으로, 인간 PBMC 및 종양 이식을 수행하였다. 종양 미세환경 내의 인간 면역 세포의 존재는 IHC에의해 확인되었다(도 2).

PBMC 공여자의 패널은 종양 미세 환경 및 허용 가능한 종양 성장 속도에서 상대적으로 높은 면역 세포 침윤을 보장하기 위해 생체 내에서 스크리브되었다(섹션 2, 도 3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

암 발달과 진행에 대한 우리의 지식은 종양 세포와 관련 기질 모두에 대한 포괄적 인 이해에 초점을 맞추어 최근 몇 년 동안 크게 발전했습니다. 숙주 면역 기계장치를 이용하는 것은 유망한 처리 전략을 나타내는 암세포에 대하여 더 중대한 충격을 유도할 수 있었습니다. 합성 및 GEM 모델과 같은 손상되지 않은 마우스 면역 체계를 가진 Murine 모델은 체크포인트 매개 면역을 연구하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 이러한 모델을 이용한 효능 평가는 주로 대리 항마우스 표적 항체13,14에의존한다. 그러나, 인간과 뮤린 면역 계통 사이의 내재적인 차이와 뮤린 모델에서 일부 인간 표적의 부족은 I-O 항종양 효과15,16의전임상 연구를 제한한다. 따라서, 인간 면역 세포와 인간 종양을 모두 포함하는 견고한 마우스 모델이 시급히 요.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 저자는 베이진에 대한 소유권을 가지고 있습니다. 통장과 강리는 본 연구에서 기술된 BGB-A317을 포함하는 특허에 대한 발명자이다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 도움이 토론에 대한 우리의 실험실의 구성원에 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 보조금 협정 번호에 따라 베이징 시 과학 기술위원회의 생물 의학 및 생명 과학 혁신 및 재배 연구 프로그램에 의해 지원되었다. Z151100000039915070 (프로젝트 "새로운 면역 종양학 항종양 약물 BGB-A317에 대한 전임상 연구"), 또한 전임상 연구를위한 내부 회사 자금 조달에 의해 부분적으로 지원되었다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBMC 분리 /Cell culture
Histopaque-1077Sigma10771세포 분리
DMEMCorning10-013-CVR세포 배양
DPBSCorning21-031-CVR세포 배양
FBSCorning35-076-CV세포 배양
페니실린-스트렙토마이신, 액상Gibco15140-163세포 배양
트립신-EDTA(0.25%), 페놀 레드Gibco25200-114세포 배양
MatrigelCorning356237 CDX 접종
FACS 분석
소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclease ISigmaDN25샘플 준비
: 콜라겐 분해 효소 유형 I시그마C0130샘플 준비
: 안티 마우스 / 인간 CD11b (M1 / 70) 항체BioLegend101206 FACS
안티 마우스 Ly-6C (HK1.4) 항체BioLegend128008FACS
안티 마우스 Ly-6G (1A8) 항체BioLegend127614FACS
안티 human CD8 (OKT8) 항체Sungene BiotechH10082-11HFACS
Anti-human CD279 (MIH4) 항체eBioscience12-9969-42FACS
Anti-human CD3 (HIT3a) 항체4A Biotech--FACS
Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow CytometerMillipore0500-4008FACS
Tumor/PDX 이식 /투여 / 측정
시클로포스파미드J& KCat#419656, CAS#6055-19-2생체 내 효능
디설피람J& KCat#591123, CAS#97-77-8생체 내 효능
주사기BD300841CDX 접종
피하 주사 바늘 (14G)Shanghai SA Mediciall & 공급자:Plastic Instruments Co., Ltd.0.7*32 TW SBPDX 접종
버니어 캘리퍼스 (MarCal)Mahr16ER종양 측정
IVC 개별 환기 케이지Lingyunboji Ltd.IVC-128동물 시설
IHC
Leica ASP200 진공 조직 처리기LeicaASP200IHC
Leica RM2235 일상 절편용 수동 로터리 마이크로톰LeicaRM2235IHC
Leica EG1150 H 가열식 파라핀 임베딩 모듈LeicaEG1150 HIHC
아리올-임상 IHC 및 FISH 스캐너LeicaAriolIHC
Anti-human CD8 (EP334) 항체ZSGB-BioZA-0508IHC
Anti-human PD1 [NAT105] 항체Abcamab52587IHC
Anti-human PD-L1 (E1L3N) 항체세포 신호 전달 기술13684SIHC
Polink-2 plus Polymer HRP Detection SystemZSGB-BioPV-9001/9002IHC
, ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  2. Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. Journal of Clinical Oncology. 33 (17), 1974-1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human PBMC Engrafted ModelHumanized Xenograft ModelImmuno oncology ResearchCyclophosphamide Disulfiram TreatmentTumor Volume MeasurementImmunohistochemical AnalysisFlow Cytometry AnalysisHuman Immune Cell InfiltrationAnti PD 1 Antibody TreatmentPatient Derived Xenografts

Related Articles