마우스 고환에서 단백질 결합 RNA를 효율적으로 식별 하기 위한 향상 된 가교 면역 침전 (eCLIP) 방법

요약

여기에서, 우리는 고환에서 RBP 후보자의 주요 RNA 표적을 결정 하는 eCLIP 프로토콜을 제시 합니다.

초록

정자 생성은 포유류에서 남성 생식 세포 분화의 고도로 주문 된 과정을 정의 합니다. 고환에서, 전사 및 번역은 결합 되지 않습니다, RBPs에 의해 조율 된 유전자 발현의 포스트 전사 조절의 중요성을 밑줄. RBP의 기계적 역할을 명료 하 게 하기 위해, 가교 면역 침전 (CLIP) 방법론은 내 인 성 직접 RNA 표적을 포착 하 고 실제 상호작용 부위를 정의 하는데 사용 될 수 있다. 향상 된 클립 (eCLIP)은 기존 클립에 비해 여러 가지 장점을 제공 하는 새롭게 개발 된 방법입니다. 그러나, eCLIP의 사용은 지금까지 확장 된 응용 프로그램에 대 한 호출, 셀 라인에 제한 되었습니다. 여기에서, 우리는 마우스 고환에서 두 개의 알려진 RNA 결합 헬 리 아 제를 연구 하기 위해 eCLIP을 사용 했습니다. MOV10 및 MOV10L1 예상한 바와 같이, 우리는 MOV10 우세 하 게 mRNA의 3 ' 미 번역 지역 (UTRs)에 결합 하 고 MOV10L1 선택적으로 Piwi 상호 작용 RNA (피 르 나) 전 구체 전사체에 묶는 것을 발견 합니다. 우리의 eCLIP 방법은 깊은 시퀀싱을 진행 하기 위한 영장으로 서브 클론의 소규모 시퀀싱 및 자격을 갖춘 라이브러리의 가용성을 통해 다양 한 RBPs에 의해 바인딩된 주요 RNA 종의 빠른 결정을 할 수 있습니다. 본 연구는 포유류 고환에서의 eCLIP에 대 한 적용 가능한 기초를 확립 한다.

서론

포유류 고환은 다 수의 정자를 생산 하기 위해 복잡 한 세포 분화 프로그램이 순환적으로 실행 되는 우수한 발달 모델을 나타낸다. 이 모델의 독특한 가치는 정자의 특정 단계에서 전사 불 활성화의 출현에 놓여 있으며, 일반적으로 meiotic 성 염색체 불 활성화 (MSCI)가 발생 하면^1,2 및 둥근 spermatogenesis가 발생할 때 ^세정 동안 급격 한 핵 압축. 이 연속적인 전사 이벤트는 RNA 결합 단백질 (RBPs)이 전사체를 형성 하 고 남성의 비 옥을 유지 하는 중요 한 역할을 하는 전사 후 유전자 조절을 필요로 합니다.

생체 내에서 개별 rbp의 선의의 rna 표적을 규명 하기 위해, 상기 가교 면역 침전 (CLIP) 법은 통상의 rna 면역 침전 (RIP)을 넘어서는것을 기준으로⁴,⁵를 개발 하였으며,⁷ , 자외선 (UV) 가교 결합, 엄격한 세척 및 겔 전달을 포함 하는....

프로토콜

모든 수행 동물 실험은 난징 의료 대학 위원회에 의해 승인 되었습니다. 수 컷 C57BL/6 마리의 마우스는 조절 된 광 기간 조건 하에서 유지 되었고, 음식과 물과 함께 공급 되었다.

1. 조직 수확 및 UV 가교 결합

1. 성인 마우스 2 개를 1-2 분 동안 또는 호흡이 멈출 때까지 이산화탄소를 이용 하 여 안락사 시켰다. 다음, 각 마우스에 자 궁 경부 탈 구를 수행.
2. 각각의 면역 침전 실험에 대 한 적절 한 연령 (본 연구에서 1 성인 고환)의 생쥐 로부터 고환의 약 100 mg을 수확 하 고,이 조직을 빙 냉 인산 완충 식 염 액 (PBS)에 배치 한다.
3. 섬세 한 팁을 가진 핀셋을 사용 하 여 튜 니 카 알 부 니 아를 부드럽게 제거 하세요.
4. 티슈 분쇄기에 3 mL의 얼음 차가운 PBS를 첨가 하 고 느슨한 유리 유 봉 (유리 유 봉)을 사용 하 여 온화한 기계적 힘으로 조직을 삼 출 합니다.
   참고: 이 단계의 목적은 세포를 lyse 하는 것이 아니라 조직을 분리 하는 것입니다. 세포 생존 력과 완전성의 보전이 중요 합니다.
5. 조직 현 탁 액을 세포 배양 접시에 옮겨 넣고 (지름 10cm), 최대....

결과

상기 eclip 절차 및 결과는도 1,도 2,도 3에 도시 되어 있다. 마우스는 외과 용가 위를 이용 하 여 하복 부에 제조 하였으며 작은 절 개를 이산화탄소로 안락사 시켰다 (도 2a,B). 마우스 고환 제거, 디 툰 후 연 삭 후 UV 가교 (그림 2c-I). 고환 조직에서 두 개의 알려진 RNA 결합 헬 리 아.......

토론

생물학적 및 병리학 적 맥락에서 rbps의 보편적 역할에 대 한 이해가 증가 함에 따라, 클립 방법은 rbps^20,32,33의 분자 기능을 공개 하는 데 널리 활용 되 고 있습니다. ^34,35. 여기에 설명 된 프로토콜은 마우스 고환에 대 한 eCLIP 방법의 적응 된 응용 프로그램을 나타냅니다.

고환에서 eCLIP을 수행 하는 한 가지 과제는 신선한 고환 세포의 생존 성과 무결성을 유지 하는 것 이며,이는 효과적인 가교 결합에도 중요 합니다. 느슨한 유 봉을 사용 하 여 온화한 기계적인 힘으로 고환을 깎는 것은 세포 용 해^32,

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Antibodies
Anti-mouse MOV10  항체	Proteintech, China	10370-1-AP
Anti-mouse MOV10L1 antibody	Zheng et al.20109	polyclonal antisera UP2175	provided by P. Jeremy Wang lab, University of Pennsylvania
HRP Goat Anti-Rabbit IgG	ABclonal	AS014
Rabbit IgG	Beyotime, 중국	A7016
장비
원심 분리기	Eppendorf, 함부르크, 독일	5242R
디지털 sonifier	BRANSON, 미국	BBV12081048A	450 와트; 50/60 Hz
DynaMag-2 자석	Invitrogen, 미국	12321D
미니 블롯 모듈	Invitrogen,USA	B1000
미니 젤 탱크	Invitrogen,USA	A25977
쉐이킹 인큐베이터	Eppendorf, 함부르크, 독일	Thermomixer 편안함
티슈 그라인더, Dounce	PYREX, USA	1234F35	전용  "느슨한" 페슬은 이 프로토콜에서 사용됩니다
TProfessional standard 96 Gradient	Biometra, 독일	일련 번호: 2604323
Tube Revolver	크리스탈, 미국	일련 번호: 3406051
UV-light cross-linker	UVP, USA	CL-1000
Materials
TC-treated Culture Dish	Corning, USA	430167	100 mm
튜브	Corning, USA	430791	15 mL
마이크로튜브 튜브	AXYGEN, USA	MCT-150-C	1.5 mL
<강력한>시약
산성 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올	Solarbio, 중국	P1011	25:24:01
AffinityScript Enzyme	Agilent, 미국	600107
Antioxidant	Invitrogen, 미국	NP0005
DH5α 유능한 박테리아	Thermo Scientific, 미국	18265017	이러한 경제적 인 세포는 >1 x 106< / sup> 형질전환 체를 수득합니다./µ g 50 µ 당 DNA를 통제하십시오; L 반응.
DMSO	Sigma-Aldrich, 미국	D8418
DNA Ladder	Invitrogen, 미국	10416014
dNTP	Sigma-Aldrich, 미국	DNTP100-1KT
Dynabeads Protein A	Invitrogen, 미국	10002D
ECL 시약	Vazyme, 중국	E411-04
EDTA	Invitrogen, 미국	AM9260G
EDTA 무료 프로테아제 억제제 칵테일	Roche, 미국	04693132001	신선한
Exo-SAP-IT	Affymetrix, 미국	78201	PCR 제품 클린업 시약
FastAP 효소	Thermo Scientific, USA	EF0652
LDS 샘플 버퍼	Thermo Scientific, USA	NP0007
MetaPhor Agarose	lonza, 스위스	50180
MgCl2	Invitrogen, 미국	AM9530G
MiniElute 겔 추출	QIAGEN, 독일	28604	컬럼 4 μm에서 저장; 버퍼 QG=겔 용해 버퍼; 버퍼 PE= 세척 버퍼(14단계용)
MyONE 실란 비드	Thermo Scientific, 미국	37002D	핵산 추출 마그네틱 비드
NaCl	Invitrogen, 미국	AM9759
NP-40	Amresco, 미국	M158-500ML
NuPAGE Bis-Tris 단백질 젤	Invitrogen, 미국	NP0336BOX	4%– 12%,1.5mm, 15웰
NuPAGE MOPS SDS 버퍼 키트	Invitrogen, 미국	NP0050
PBS	Gibco, 미국	10010023
위상 잠금 젤 (PLG) 무거운 튜브	TIANGEN, 중국	WM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems, USA	A25742
Proteinase K	NEB, New England	P8107S
Q5 PCR 마스터 믹스	NEB, 뉴잉글랜드	M0492L
RLT 버퍼	QIAGEN, 독일	79216	RNA 정제 용해 버퍼
RNA 클린 & 집중 장치-5 열	ZYMO RESEARCH, USA	R1016	RNA 정제 및 농도 컬럼
RNase I	Invitrogen, 미국	AM2295
RNase 억제제	Promega, 미국	N251B
RQ1 DNase	Promega, 미국	M610A
샘플 환원제	Invitrogen, 미국	NP0009
SDS 솔루션	Invitrogen, 미국	15553027	10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich, USA	30970	보호 가벼운
T4 PNK 효소	NEB, 뉴잉글랜드	M0201L
T4 RNA 리가제 1 고농도	NEB, 뉴잉글랜드	M0437M
TA/Blunt-Zero 클로닝 믹스	Vazyme, 중국	C601-01
TBE	Invitrogen, USA	AM9863
Tris-HCI Buffer	Invitrogen, 미국	15567027
Triton X-100	Sangon Biotech, 중국	A600198
Tween-20	Sangon Biotech, 중국	A600560
	Urea Sigma-Aldrich, 미국	U5378
X-ray Films	Caresteam, 캐나다	6535876

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