Préparation de la souris Retinal Cryo-sections pour l'immunohistochimie

Summary

Ce rapport décrit des méthodes complètes pour préparer les sections congelées de rétine de souris pour l’immunohistochimie (IHC). Les méthodes décrites incluent la dissection de la tasse postérieure oculaire, la fixation de paraformaldehyde, l’intégration dans la température de coupe optimale (OCT) orientation de médias et de tissu, sectionnement et immunostaining.

Abstract

La préparation de sections oculaires de souris de haute qualité pour l’immunohistochimie (IHC) est essentielle pour évaluer la structure et la fonction rétiniennes et pour déterminer les mécanismes sous-jacents aux maladies rétiniennes. Le maintien de l’intégrité structurelle tout au long de la préparation des tissus est essentiel pour obtenir des données reproductibles du CIH rétinien, mais peut être difficile en raison de la fragilité et de la complexité de la cytoarchitecture rétinienne. Des fixatifs forts comme la formaline de 10 % ou la solution de Bouin préservent de façon optimale la structure rétinienne, ils entravent souvent l’analyse du CiSE en améliorant la fluorescence de fond et/ou en diminuant les interactions anticorps-épitopes, un processus connu sous le nom de masquage épitope. Les fixatifs plus doux, d’autre part, comme le paraformaldéhyde de 4%, réduit la fluorescence de fond et les techniques méticuleuses de dissection d’épitope-masquant doivent être employées pour préserver la structure rétinienne. Dans cet article, nous présentons une méthode complète pour préparer des tasses postérieures oculaires de souris pour IHC qui est suffisante pour préserver la plupart des interactions anticorps-épitope sans perte de l’intégrité structurale rétinienne. Nous incluons le CiPH représentatif avec des anticorps à divers marqueurs de type de cellules rétiniennes pour illustrer la conservation et l’orientation de tissu dans des conditions optimales et sous-optimales. Notre objectif est d’optimiser les études IHC de la rétine en fournissant un protocole complet de la dissection oculaire de tasse postérieure à IHC.

Introduction

L’immunohistochimie (IHC) est une technique puissante pour localiser des protéines spécifiques et des structures cellulaires dans les tissus in situ^1,2,3. Des méthodes de fixation inappropriées et une section sous-optimale de tissus complexes peuvent perturber la structure des tissus, générer une coloration de fond élevée ou diminuer les interactions anticorps-épitopètes, ce qui entraîne la coloration d’artefacts et, par conséquent, une mauvaise interprétation des Données du CSI⁴. Comme la rétine des vertébrés est un organe neuronal complexe et très organisé composé de strates de photorécepteurs interconnectés, d’interneurones et de cellules ganglionnaires, il est très fragile et peut être facilement perturbé lors de la dissection et de la section. Un protocole détaillé, normalisé et validé, de la dissection et de l’orientation des yeux de souris à l’immunostaining, aidera à réduire considérablement les artefacts du CiSE, ce qui augmentera la fiabilité des résultats et permettra d’obtenir des données comparatives plus précises. analyse.

Il existe de nombreux protocoles pour la préparation des tissus pour le CiSE, cependant, tous ne sont pas adaptés pour le tissu rétinien. Des fixatifs solides comme la formaline de 10 % ou la solution de Bouin préservent la structure rétinienne pendant la dissection et la section⁵. Malheureusement, les fixatifs forts mènent souvent à la fluorescence de fond amélioréeet au masquage d’épitope dû à la modification chimique des épitopes 6. D’autre part, des fixatifs plus doux, comme le paraformaldéhyde (PFA) de 4 %, peuvent soulager certains de ces artefacts, mais nécessitent une dissection méticuleuse et des sections pour préserver la structure rétinienne optimale. PfA pénètre rapidement les tissus, mais les protéines transversales très lentement, réduisant le risque de masquage épitope. Étant donné que l’incubation de PFA de courte durée est une fixation relativement légère, les tissus nécessitent souvent une congélation rapide pour préserver les antigènes. Il est important d’éviter la formation de cristaux de glace pendant la congélation des tissus car ils déforment et endommagent l’intégrité des cellules et des tissus⁷.

Ici nous décrivons des protocoles détaillés et normalisés pour la dissection, la fixation, et la cryo-protection des tasses postérieures oculaires de souris qui donnent des données cohérentes et fiables de IHC.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été mises en œuvre dans le strict respect des recommandations du Guide national des instituts de santé pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire fournis par l’Institut des ressources animales de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Pennsylvanie. Tous les outils et équipements pour les méthodes sont indiqués à la figure 1</s…

Representative Results

Pour illustrer comment ces protocoles, assurer la conservation rétinienne optimale pour IHC, nous avons sondé les sections rétiniennes des souris P28 WT (C57BL/6N) avec des anticorps à la rhodopsine (un marqueur photorécepteur)8, décarboxylase d’acide glutamique 65 (Gad65, cellule amacrine marqueur)9, la glutamine synthetase (GS, un marqueur cellulaire de M-ller)10, et la calbindine (un marqueur cellulaire horiz…

Discussion

La dissection de la rétine de la souris est un processus délicat en raison de la petite taille et la forme des yeux de souris et de la fragilité du tissu rétinien. Même si la dissection de haute qualité est une question de pratique, avoir un protocole détaillé, fournir des méthodes et des conseils efficaces est une nécessité pour obtenir des sections rétiniennes et IHC. En plus des protocoles décrits ici, il y a plusieurs bouts qui tiennent des sections rétiniennes cohérentes de haute qualité qui convienn…

Materials

6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives – Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods