Подготовка крио-секций мышиной подвздошной сыки для иммуногистохимии

Summary

В настоящем докладе описаны комплексные методы подготовки замороженных секций сетчатки мыши для иммуногистохимии (IHC). Описанные методы включают вскрытие глазной задней чашки, параформальдегидная фиксация, встраивание в оптимальную температуру резки (OCT) носителей и ориентации тканей, секционирование и иммуностоирование.

Abstract

Подготовка высококачественных секций глаз мыши для иммуногистохимии (IHC) имеет решающее значение для оценки структуры и функции сетчаточной системы и для определения механизмов, лежащих в основе заболеваний сетчаточной железы. Поддержание структурной целостности на протяжении всей подготовки ткани имеет жизненно важное значение для получения воспроизводимых данных IHC сетчатого, но может быть сложной задачей из-за хрупкости и сложности цитоархитектуры сетчаточной системы. Сильные фиксаторы, как 10% формалин или решение Буин оптимально сохранить структуру сетчатки, они часто препятствуют анализУ IHC путем повышения фоновой флуоресценции и / или уменьшение антител-эпитопов взаимодействий, процесс, известный как эпитоп маскировки. Мягкие фиксаторы, с другой стороны, как 4% параформальдегида, снижает фоновой флуоресценции и эпитоп-маскировки, тщательные методы вскрытия должны быть использованы для сохранения структуры сыворотки. В этой статье мы представляем комплексный метод подготовки мыши глазной задней чашки для IHC, что достаточно, чтобы сохранить большинство антител-эпитоп взаимодействия без потери структурной целостности сетчатых. Мы включаем представительный IHC с антителами к различным маркерам типа сетчаточных клеток, чтобы проиллюстрировать сохранение тканей и ориентацию в оптимальных и неоптимальных условиях. Наша цель заключается в оптимизации IHC исследований сетчатки путем предоставления полного протокола от глазной задней чашки вскрытия IHC.

Introduction

Иммуногистохимия (IHC) является мощным методом для локализации конкретныхбелков и клеточных структур в тканях на месте 1,^2,3. Неуместные методы фиксации и субоптимальное сечение сложных тканей могут нарушить структуру тканей, генерировать высокие фоновые окрашивания или уменьшать антитела-эпитопные взаимодействия, что приводит к окрашиванию артефактов и последующему неправильному толкованию Данные IHC⁴. Поскольку позвоночную сетчатку является сложным и высокоорганизованным нервным органом, состоящим из слоев взаимосвязанных фоторецепторов, интернейронов и ганглия-клеток, она очень хрупкая и может быть легко нарушена во время вскрытия и секции. Подробный, стандартизированный и проверенный протокол от вскрытия глаз мыши и ориентации на иммуно-стоикирование поможет значительно уменьшить iHC артефакты, тем самым повышая надежность результатов и позволяя более точные сравнительные данные Анализа.

Есть много протоколов для подготовки тканей для IHC, однако, не все подходят для ткани сетчатины. Сильные фиксаторы, такие как 10% формалин или решение Bouin сохранить структуру сытины во время вскрытия и секции⁵. К сожалению, сильные фиксаторы часто приводят к усиленной фоновой флуоресценции и маскировке эпитопов из-за химической модификации эпитопов^6. С другой стороны, более мягкие фиксаторы, как 4% параформальдегида (PFA) может облегчить некоторые из этих артефактов, но требуют тщательного вскрытия и сечения, чтобы сохранить оптимальную структуру сетчатого глаза. ПФА быстро проникает в ткани, но перекрестные белки очень медленно, снижая риск маскировки эпитопа. Поскольку короткое время инкубации ПФА является относительно мягкой фиксации, ткани часто требуют быстрого замораживания для сохранения антигенов. Важно, чтобы избежать образования кристалла льда во время замораживания тканей, как они искажают и повреждения целостности клеток и тканей⁷.

Здесь мы описываем подробные и стандартизированные протоколы для вскрытия, фиксации и криозащиты мыши глазных задних чашек, которые дают последовательные и надежные данные IHC.

Protocol

Все описанные здесь методы были выполнены в строгом соответствии с рекомендациями Национального руководства по охране здоровья по уходу и использованию лабораторных животных, предоставленными Институтом лабораторных ресурсов животных, и были одобрены Институциональный комитет по ?…

Representative Results

Чтобы проиллюстрировать, как эти протоколы, обеспечить оптимальное сохранение сетчатки для IHC, мы исследовали участки сетчатки от p28 WT мышей (C57BL/6N) с антителами к родопсину (маркер фоторецептора)8, глутаминовой кислотой decarboxylase 65 (Gad65, амакринная клетка марк?…

Discussion

Рассечение сетчатки мыши является деликатным процессом из-за небольшого размера и формы мыжеток и хрупкости ткани сетчатки. Несмотря на то, что выполнение высококачественного вскрытия является вопросом практики, наличие детального протокола, предоставление эффективных методов и сов…

Materials

6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives – Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods