Summary

Het gebruiken van dichtbijgelegen-infrarode fluorescentie en hoge resolutie het scannen om eiwituitdrukking in de knaagdieren hersenen te meten

Published: May 23, 2019
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol dat near-infrarood kleurstoffen gebruikt in combinatie met Immunohistochemistry en hoge-resolutie scannen naar eiwitten in hersengebieden te testen.

Abstract

Neurowetenschappen is de studie van hoe cellen in de hersenen verschillende functies bemiddelen. Het meten van eiwitexpressie in neuronen en glia is van cruciaal belang voor de studie van de neurowetenschappen als cellulaire functie wordt bepaald door de samenstelling en activiteit van cellulaire eiwitten. In dit artikel beschrijven we hoe immunocytochemie kan worden gecombineerd met bijna-infrarood scannen met hoge resolutie om een semi-kwantitatieve maat van eiwitexpressie in verschillende hersengebieden te bieden. Deze techniek kan worden gebruikt voor enkele of dubbele eiwitexpressie in hetzelfde hersengebied. Het meten van proteïnen op deze manier kan worden gebruikt om een relatieve verandering in eiwituitdrukking met een experimentele manipulatie, moleculaire handtekening van het leren en geheugen, activiteit in moleculaire wegen, en neurale activiteit in veelvoudige hersenengebieden te verkrijgen. Met behulp van de juiste eiwitten en statistische analyse, functionele connectiviteit tussen hersengebieden kan ook worden bepaald. Gezien het gemak van de uitvoering immunocytochemie in een laboratorium, met behulp van immunocytochemie met near-infrarood hoge-resolutie scannen kan het vermogen van de neuro om neurobiologische processen te onderzoeken op een systeemniveau uit te breiden.

Introduction

De studie van neurowetenschappen betreft een onderzoek van hoe de cellen in de hersenen specifieke functies bemiddelen1. Deze kunnen worden cellulaire in de natuur, zoals hoe glia cellen verlenen immuniteit in het centrale zenuwstelsel of kan betrekken experimenten die gericht zijn om uit te leggen hoe de activiteit van neuronen in de dorsale Hippocampus leidt tot ruimtelijke navigatie. In brede zin wordt de cellulaire functie bepaald door de eiwitten die worden uitgedrukt in een cel en de activiteit van deze eiwitten2. Als gevolg daarvan, het meten van de expressie en/of activiteit van eiwitten in hersencellen zijn van cruciaal belang voor de studie van de neurowetenschappen.

Een aantal technieken zijn beschikbaar om eiwituitdrukking in de hersenen te meten. Deze omvatten in vivo methodes zoals positron emissie topografie voor receptor dichtheid3 en micro-dialyse voor kleine peptides4. Meer algemeen, ex vivo methoden worden gebruikt om de eiwitfunctie en expressie te onderzoeken. Deze omvatten massaspectrometrie technieken5, westelijke vlek en enzym-verbonden immunosorbent ASSAY (Elisa)6, en immunocytochemie7. Immunocytochemie wordt veel gebruikt op het gebied van neurowetenschappen. Deze techniek impliceert het gebruik van een primair antilichaam om een proteïne (of antigeen) van belang (b.v., c-FOS) en een geconjugeerd secundair antilichaam te ontdekken om het eiwit-primaire antilichamen complex te ontdekken (Figuur 1). Om opsporing van het eiwit-primaire antilichaam-secundair antilichamen complex toe te laten, hebben de secundaire antilichamen oxyderende agenten zoals mierikswortelperoxidase (HRP) die aan hen wordt vervoegd. Dit zorgt voor de vorming van precipitaten in cellen die kunnen worden gedetecteerd met behulp van lichte microscopie7. Secundaire antilichamen kunnen ook chemicaliën op te lichten geconjugeerde aan hen (dat wil zeggen, fluorophores). Wanneer bevorderd deze chemische producten licht uitstoten, dat kan worden gebruikt om proteïne-primair antilichaam-secundaire antilichamen complexen te ontdekken7. Ten slotte, soms hebben de primaire antilichamen het verminderen van agenten en fluorescentie chemische producten aan hen direct ontkennend de behoefte aan secundaire antilichamen7 (Figuur 1).

Interessant, vele immunocytochemie methodes staan voor visualisatie van proteïnen in hersenen cellen toe, maar niet de capaciteit om de hoeveelheid proteïne in een specifieke cel of een hersenengebied te kwantificeren. Het gebruik van lichte microscopie om precipitaten van reductiereacties op te sporen zorgt voor visualisatie van neuronen en glia, maar deze methode kan niet gebruikt worden om eiwitexpressie in cellen of in een specifiek hersengebied te kwantificeren. In theorie, kan de fluorescentie microscopie voor dit worden gebruikt, omdat het licht dat van het fluorescente secundaire antilichaam wordt uitgezonden een maatregel van het eiwit-primaire antilichaam-secundaire antilichamen complex is. Nochtans, kan autofluorescentie in hersenenweefsel het moeilijk maken om fluorescentie microscopie te gebruiken om eiwituitdrukking in hersenenweefsel te kwantificeren8. Dientengevolge, wordt het licht dat van fluorescente beelden van hersenenweefsel wordt uitgezonden zelden gebruikt om eiwituitdrukking in de hersenen te kwantificeren.

Veel van deze problemen kunnen worden aangepakt met behulp van near-infrarood immunocytochemie in combinatie met hoge-resolutie scannen9,10. In dit artikel beschrijven we hoe immunocytochemie in combinatie met fluorophores in de near-infrarood emissie Spectra gecombineerd kan worden met hoge resolutie scanning (bijv. 10 – 21 µm) om scherpe beelden te verkrijgen die een semi-kwantificering van eiwitten mogelijk maken in verschillende hersengebieden.

Protocol

Het volgende protocol werd goedgekeurd door het institutioneel Comité voor Dierverzorging en-gebruik (DEC) van de Universiteit van Delaware. Mannelijke Sprague Delombaerde ratten ongeveer 55 – 75 dagen oud werden gebruikt voor dit protocol. 1. Brain extractie en weefsel voorbereiding Verdoven rat met Isofluraan in anesthesie inductie kamer tot rat niet langer vertoont een reactie op voet knijpen. Offer ratten via een snelle onthoofding met behulp van een guillotine….

Representative Results

Voorafgaand aan het gebruik van hoge-resolutie scannen voor Immunohistochemistry, moet men controleren of het protocol werkt. Dit kan worden bereikt gebruikend een bevestigings analyse waar de hersenen secties van het zelfde dier met primaire en secundaire antilichamen, secundair antilichaam alleen, of noch primair noch secundair antilichaam worden uitgebroed. De resultaten voor een dergelijke validatie test worden weergegeven in Figuur 2. In deze reactie war…

Discussion

De resultaten in dit artikel tonen aan dat near-infrarood immunocytochemie in combinatie met scannen met hoge resolutie kan worden gebruikt voor het verkrijgen van semi-kwantitatieve maatregelen van eiwitexpressie in hersenweefsel. Het kan ook worden gebruikt om twee eiwitten gelijktijdig label in hetzelfde hersengebied. We hebben eerder gebruikt near-infrarood immunohistochemistry te meten onmiddellijke vroege genexpressie in meerdere hersengebieden9,10. De dire…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het onderzoek in dit rapport werd gefinancierd door een doel subsidie van de NIGMS (1P20GM103653) toegekend aan DK.

Materials

Brain Extraction
Anesthesia Induction Chamber Kent Scientific VetFlo-0530SM
Kleine Guillotine Harvard Apparatus 73-1920
Friedman Rongeur Fine Science Tools 16000-14 used to remove back of skull
Delicate Dissecting Scissors Fischer Scientific 08-951-5 used to cut upward along midline of skull
Micro Spatula Fischer Scientific 21-401-5 used to scoop out brain
Glass Microscope Slides Fischer Scientific 12-549-6
Immunohistochemical Reaction
 Triton X-100 Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody 
Tween-20 Used as a small amount of detergent added to TBS  to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody
Licor Odyssey scanner Licor Biotechnology Inc.
Image Studio Licor Biotechnology Inc.

References

  1. Kandel, E. R. . Principles of Neural Science. , (2013).
  2. Byrne, J. H., Roberts, J. L. . From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , (2009).
  3. Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
  4. Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
  5. English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
  6. David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
  7. Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
  8. Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
  9. Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
  10. Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
  11. Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
  12. Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
  13. Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. , (2018).
  14. Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).

Play Video

Cite This Article
Kimmelmann-Shultz, B., Mohmammadmirzaei, N., Caplan, J., Knox, D. Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (147), e59685, doi:10.3791/59685 (2019).

View Video