근 적외선 형광 및 고 분해능 주사를 사용 하 여 설치류 뇌의 단백질 발현 측정

요약

여기서, 우리는 뇌 영역에서 단백질을 분석 하기 위해 면역 조직 화학 및 고해상도 스캔과 함께 근 적외선 염료를 사용 하는 프로토콜을 제시 합니다.

초록

신경 과학은 두뇌에 있는 세포가 각종 기능을 중재 하는 방법의 연구 결과입니다. 세포 기능이 세포 단백질의 조성과 활동에 의해 결정 되기 때문에 뉴런 및 글 리아에서 단백질 발현을 측정 하는 것은 신경 과학의 연구에 매우 중요 합니다. 이 기사에서는 면역 세포 화학이 근 적외선 고 분해능 스캔과 결합 되어 별개의 뇌 영역에서 단백질 발현에 대 한 반 정량 측정을 제공 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 동일한 뇌 영역에서 단일 또는 이중 단백질 발현에 사용 될 수 있다. 이러한 방식으로 단백질을 측정 하는 것은 실험 조작, 학습 및 기억력의 분자 서명, 분자 경로의 활성 및 여러 뇌 영역에서의 신경 활동으로 단백질 발현의 상대적인 변화를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 올바른 단백질과 통계 분석을 사용 하 여 뇌 영역 간의 기능적 연결성도 확인할 수 있습니다. 실험실에서 면역 세포 화학 작용의 용이성을 감안할 때, 근 적외선 고 분해능 스캐닝으로 면역 세포 화학을 사용 하는 것은 신경 과학자가 시스템 수준에서 신경 생물학 프로세스를 검사 하는 능력을 확장할 수 있습니다.

서론

신경 과학의 연구는 두뇌에 있는 세포가 특정 기능을 중재 하는 방법¹에 대 한 조사에 관련 됩니다. 이러한 세포가 중추 신 경계에서 면역을 부여 하는 방법과 같은 자연에서 세포가 될 수 있거나 등 쪽 해 마에서 뉴런의 활동이 공간적 탐색으로 이어지는 방법을 설명 하는 것을 목표로 하는 실험을 포함 할 수 있습니다. 광범위 한 의미에서, 세포 기능은 세포에서 발현 되는 단백질 및 이들 단백질²의 활성에 의해 결정 된다. 결과적으로 뇌 세포에서 단백질의 발현 및/또는 활성을 측정 하는 것은 신경 과학의 연구에 중요 합니다.

두뇌에 있는 단백질 발현을 측정 하기 위하여 다 수 기술이 이용 가능 합니다. 이들은 작은 펩 티 드를 위한 수용 체 밀도³ 및 미세 투 석을 위한 양전자 방출 지형과 같은 생체 내 방법을 포함 한다⁴. 보다 일반적으로, ex 생체 내 방법은 단백질 기능 및 발현을 검사 하는 데 사용 됩니다. 이들은 질량 분석 법⁵, 웨스턴 블 롯 및 효소 결합 면역 흡수 법 (ELISA)⁶

프로토콜

다음 의정서는 델라웨어 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었다. 이 프로토콜에는 약 55 ~ 75 일이 사용 되었다.

1. 뇌 추출 및 조직 준비

1. 쥐가 더 이상 발 핀치에 대 한 응답을 전시 하지 때까지 마 취 유도 챔버에 아이 소 루 레인으로 쥐를 마비.
2. 길로 틴을 사용 하 여 빠른 침 강을 통해 쥐를 희생.
3. 두개골 후부에 피부를 자르고 두개골 꼭대기에서 지웁니다.
4. 신중 하 게 두개골의 뒤쪽 부분을 제거 하기 위해 rongeurs를 사용 하 여, 두개골의 중간 선을 잘라 작은 해 부가 위를 사용 하 여, 뇌 조직의 손상을 방지 하기 위해 항상 두개골의 상단에 대 한 위로 밀어.
5. 사용 rongeurs 뇌를 노출 하는 두개골의 오른쪽 및 왼쪽 절반을 벗 겨.
6. 작은 주걱을 사용 하 여 뇌 밑으로 스 쿱과 신경을 절단 하 고 드라이 아이스 (최소 20°c)에서 획기적 차게 하 여 두뇌를 강화 하 고 두뇌를 동결 시키십시오. 그 후, 슬라이스 할 때까지-80 ° c 냉동 고에 뇌를 저장 합니다.
7. -9 ° c와-12 ° c 사이에서 유지 되는 저온 상태에서 30 ~ 50 µm의 관심 영역에서 뇌....

결과

면역 조직 화학에 대 한 고해상도 스캐닝을 사용 하기 전에 프로토콜이 작동 하는지 확인 해야 합니다. 이는 동일한 동물의 뇌 부분이 1 차 및 2 차 항 체, 2 차 항 체가 단독으로 또는 1 차 또는 2 차 항 체와 함께 인큐베이션 되는 유효성 검사 분석을 사용 하 여 달성할 수 있습니다. 이러한 유효성 검사 분석에 대 한 결과는 도 2에 나타내 었 다. 이 반응에서 우리는 등 쪽 해 마 및 편도 체에서 즉각적인 초기 유전자 c 준을 검출 하였다. 3 월 발현은 뇌 조직에 일차 및 이차 항 체가 적용 되었을 때에만 관찰 되었다.

그림 3 은 편도 핵에서 이중 단백질 검출을 보여줍니다. 이 실험에서 우리는 동일한 뇌 조직에서 α-아미노-3-하이드 록 시 Gl.......

토론

이 기사에서 제시 된 결과는 근 적외선 면역 세포 화학이 고 분해능 스캐닝과 결합 하 여 뇌 조직에서 단백질 발현의 반 정량적 측정을 얻는 데 사용 될 수 있음을 보여준다. 또한 동일한 뇌 영역에서 동시에 두 개의 단백질을 라벨링 하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이전에 여러 뇌 영역에서 즉각적인 초기 유전자 발현을 측정 하기 위해 근 적외선 면역 조직 화학을 사용 하였다^9,10. 즉각적인 초기 유전자는 신경 활동의 척도로 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 즉각적인 초기 유전자 (IEGs)의 상관관계가 있는 수준으로 뇌 지역을 그룹화 하는 것을 허용 하는 통계적 인 분석에 단백질 표현의이 반 정량적 측정을 복종 시켰습니다. 이를 기능적 연결성의 척도로 사용 하 여 정서적 학습 및 메모리^9,10동안 공포 회로 내에서 노.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
뇌 추출
마취 유도 챔버	Kent Scientific	VetFlo-0530SM
Kleine Guillotine	Harvard Apparatus	73-1920
Friedman Rongeur	Fine Science Tools	16000-14	두개골 뒤쪽을 제거하는 데 사용
섬세한 해부 가위	Fischer Scientific	08-951-5	두개골의 중심선을 따라 위쪽으로 자르는 데 사용됩니다.
Micro Spatula	Fischer Scientific	21-401-5	뇌를 퍼내는 데 사용됩니다
유리 현미경 슬라이드	Fischer Scientific	12-549-6
면역조직화학 반응
Triton X-100			은 파라포름알데히드에 고정된 후 세포를 투과시키는 중성 세제로 사용되며, 호스트 세럼 및 보조 항체와 함께 중성 세제로도 사용됩니다
Tween-20			TBS 에 첨가되는 소량의 세제로 사용되며, 주요 항체
Licor Odyssey 스캐너 Licor	Biotechnology Inc
이미지 스튜디오	Licor Biotechnology Inc.

는 . .로 슬라이드를 커버슬립한 후 TBS-T를 처리하는 데 사용됩니다.