Valutazione della reattività del tono vascolare utilizzando arterie mesenteriche isolate con un focus sulla modulazione dei tessuti adiposi perivascolare

Summary

Il protocollo descrive l’uso della Miografia dei fili per valutare la tensione isometrica transmurale delle arterie mesenteriche isolate dai topi, con particolare attenzione alla modulazione da fattori rilasciati da cellule endoteliali e tessuti adiposi perivascolare.

Abstract

Alterazione del tono vascolare reattività agli stimoli fisiopatologici contribuisce allo sviluppo di una vasta gamma di malattie cardiovascolari e metaboliche. La disfunzione endoteliale rappresenta un grave colpevole per la ridotta vasodilatazione e una maggiore vasocostrizione delle arterie. Adiposo (grasso) tessuti che circondano le arterie svolgono ruoli importanti nella regolazione del rilassamento endotelio-dipendente e/o contrazione delle cellule muscolari lisce vascolari. I colloqui incrociati tra l’endotelio e i tessuti adiposi perivascolare possono essere valutati ex vivo utilizzando vasi sanguigni montati da un sistema di Miografia a filo. Tuttavia, dovrebbero essere stabilite impostazioni ottimali per le arterie derivate da animali di diverse specie, età, background genetici e/o condizioni fisiopatologiche.

Introduction

Le dilatazioni e le costrizioni delle arterie sono raggiunte da rilassanti e contrazioni, rispettivamente, delle loro cellule muscolari lisce vascolari. I cambiamenti nella reattività vascolare delle piccole arterie contribuiscono alla regolazione omeostatica della pressione arteriosa da parte dei nervi autonomici e degli ormoni presenti nel sangue (ad esempio, catecolamine, angiotensina II, serotonina, vasopressina). A livello locale, le risposte vascolari delle cellule muscolari lisce sono modulate dai segnali provenienti sia dalle cellule endoteliali dell’intima che dal tessuto adiposo che circonda le arterie (Figura 1).

L’endotelio non è solo una barriera passiva, ma funge anche da superficie per scambiare segnali tra il sangue e le cellule muscolari lisce vascolari sottostanti. Rilasciando varie sostanze vasoattive, l’endotelio svolge un ruolo critico nel controllo locale delle risposte di tono vascolare¹. Ad esempio, in risposta all’acetilcolina, l’ossido nitrico sintasi (eNOS) endoteliale viene attivato nell’endotelio per produrre ossido nitrico (no), che induce il rilassamento del muscolo liscio vascolare sottostante attivando guanil ciclasi solubile (SGC) ². altre sostanze vasoattive includono i prodotti di cicloossigenasi (ad esempio, prostaciclina e trombossano a₂), lipossigenasi (ad es., 12-idrossietilosatetraenoico, 12-HETE) e monoossigenasi del citocromo P450 (HETEs e acido epoxyeicosatrienoico, S.e.t.), specie reattive dell’ossigeno (ROS) e peptidi vasoattivi (ad es., endothelin-1 e angiotensina II), e fattori iperpolarizzanti derivati dall’endotelio (EDHF)³. Un delicato equilibrio tra vasodilatatori e vasocostrittori derivati dall’endotelio mantengono il tono vasomotore locale^4,5.

La disfunzione endoteliale è caratterizzata dalla compromissione dell’endothelio-dipendente vasodilatazione⁶, un segno distintivo di invecchiamento vascolare⁷. Con l’età, la capacità di endotelio per promuovere la vasodilatazione è progressivamente ridotta, dovuto in gran parte a una diminuzione della biodisponibilità NO, così come l’espressione anormale e la funzione di eNOS nell’endotelio e sGC nelle cellule muscolari lisce vascolari^{8 , 9} il ^{, 10}. riduzione della biodisponibilità non potenzia la produzione di vasocostrittori dipendenti dall’endotelio^11,12. Nelle arterie invecchiate, la disfunzione endoteliale provoca iperplasia nei media, come riflessa dai marcati aumenti dello spessore della parete, numero di nuclei mediali, che ricordano l’ispessimento arterioso nell’ipertensione e l’aterosclerosi osservata negli esseri umani pazienti^13,14. Inoltre, le condizioni fisiopatologiche come l’obesità, il diabete o l’ipertensione accelerano lo sviluppo della disfunzione endoteliale^15,16.

Tessuto adiposo perivascolare (pvat) rilascia numerosi adipochine per regolare la struttura vascolare e la funzione¹⁷. L’effetto anti-contrattile di pvat è mediato da fattori rilassanti, come adiponectina, no, perossido di idrogeno e solfuro di idrogeno^18,19,20. Tuttavia, a seconda della posizione e della condizione patofisiologica, PVAT può anche migliorare le risposte contrattili in varie arterie²¹. Le sostanze pro-contrattili prodotte da pvat includono l’angiotensina-II, la leptina, la resistina e la Ros^22,23.  Nella maggior parte degli studi sui vasi sanguigni isolati, il PVAT è stato considerato come un semplice supporto strutturale per la vascolarizzazione e quindi rimosso durante la preparazione dei segmenti di anello dei vasi sanguigni. Poiché la disfunzione adiposa rappresenta un fattore di rischio indipendente per l’ipertensione e le complicanze cardiovascolari associate²⁴, il pvat che circonda i vasi sanguigni deve essere considerato quando si studia la reattività vascolare di diverse arterie.

I sistemi di miografo multifilo sono stati ampiamente utilizzati per indagare le funzioni vasomotore di una varietà di vasi sanguigni, tra cui l’aorta, mesenterica, renale, femorale, cerebrale e arterie coronarie^25,26. I protocolli qui descritti utilizzeranno la Miografia dei fili per valutare la reattività vascolare nelle arterie mesenteriche isolate da modelli murini geneticamente modificati, con particolare attenzione alla modulazione da parte di PVAT.

Protocol

Tutti gli animali utilizzati per il seguente studio sono stati forniti dal laboratorio animale unità della facoltà di medicina, l’Università di Hong Kong. L’approvazione etica è stata ottenuta dal Comitato dipartimentale sull’uso degli animali da laboratorio per l’insegnamento e la ricerca (CULATR, no.: 4085-16). 1. i preparativi Preparazione di farmaci Conservare i farmaci in modo appropriato come indicato nella scheda di sicurezza dei materiali (MSDS)…

Representative Results

Esame delle relazioni di lunghezza/tensione per ottenere il fattore di normalizzazione k La quantità di tratto applicato a un segmento di vaso influenza l’entità dell’interazione actina-miosina e quindi la forza attiva massima sviluppata. Così, per ogni tipo di vaso sanguigno, determinare la quantità di tratto necessario per la massima forza attiva è necessaria per gli studi di Miografia corretta. …

Discussion

Oltre alle cellule endoteliali, i segnali derivati da PVAT giocano un ruolo importante nella regolazione della reattività del tono muscolare liscio³⁰. Sana pvat rilascia No e anti-infiammatori adiponectina per esercitare un effetto anti-contrattile sulle arterie, che si perde in condizioni patologiche come l’obesità e la sindrome metabolica^31,32. Negli Stati di malattia, la pvat contribuisce allo sviluppo della disfunzione endoteliale e …

Materials

Acetylcholine	Sigma-Aldrich	A6625	Stock concentration: 10-1 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)	Sigma-Aldrich	N5751	Stock concentration: 3 x 10-2 M Working concentration: 10-4 M
Phenylephrine	Sigma-Aldrich	P6126	Stock concentration: 10-2 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M
U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α)	Enzo	BML-PG023-0001	Stock concentration: 10-5 M Working concentration: 1-3 x 10-8 M
Multiwire myograph	Danish MyoTechnology (DMT)	620M
PowerLab 4/26	ADInstruments	ML848
Labchart7	ADInstruments	–
Adipo-SIRT1 wild type mice	Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong	CULATR NO.: 4085-16
Silicon-coated Petri dishes	Danish MyoTechnology (DMT)
Tungsten wires	Danish MyoTechnology (DMT)	300331
Surgical tools