末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化
Summary
このプロトコルは、仙台ウイルス感染による神経幹細胞を誘導する末梢血単核細胞のリプログラミング、ドーパミン作動性ニューロンへのiNSCの分化、DA前駆体の一方的な病変への移植を提示するパーキンソン病マウスモデル、およびPD治療のためのiNSC由来DA前駆体の安全性および有効性の評価。
Abstract
パーキンソン病(PD)は、腹部メセンスファロン(VM)における基数ニグラパースコンパクター(SNpc)におけるドーパミン作動性(DA)ニューロンの変性によって引き起こされる。細胞置換療法はPDの治療に大きな期待を寄せており、最近、腫瘍形成のリスクが低下し、可塑性が生じるため、誘導神経幹細胞(iNSC)が細胞補充療法の候補として浮上している。領域特異的ニューロンとグリア。iNSCは、線維芽細胞、末梢血単核細胞(PBMNC)および様々な他のタイプの細胞などの自家体細胞源から再プログラムすることができる。他のタイプの体細胞と比較して、PBMNCは培養中にアクセスし、拡大しやすいので魅力的なスターターセルタイプです。センダイウイルス(SeV)は、ヒトOCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCを含む再プログラミング因子をコードするRNA非統合型ウイルスであり、ネグレーション、一本鎖、非セグメントゲノムを有し、 宿主ゲノムは、感染した細胞の細胞質でのみ複製し、リプログラミングのための効率的で安全な手段を提供する。本研究では,PBMNCを再プログラミングしてiNSCを得るプロトコルを用いて,2段階の方法で特殊なVM DAニューロンに分化するプロトコルについて述べた.次に、DA前駆体を一方的に6-ヒロキシドパミン(6-OHDA)病変PDマウスモデルに移植し、PDの治療の安全性と有効性を評価する。この方法は、インビトロおよびインビボにおける患者特異的DA神経細胞の機能および治療効果を調べるためのプラットフォームを提供する。
Introduction
パーキンソン病(PD)は、視室メゼンサロン(VM)におけるドーパミン作動性(DA)ニューロンの変性によって引き起こされる一般的な神経変性疾患であり、60歳以上の人口で1%以上の有病率を有する。1,2.過去10年間にわたり、細胞療法は、変性または損傷した細胞を置き換えるか、または変性ニューロンの周りの微小環境に栄養を与えることを目的とし、PD3の治療における可能性を示している。一方、リプログラミング技術は、補充療法のための有望な細胞源を提供する4、大きな進歩を遂げました。ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)と胚性幹細胞(ESC)は、ラットおよび非ヒト霊長類PDモデルに移植すると、生き残り、母性、運動機能を改善することができるDA神経細胞に分化できることが証明されている5 ,6,7,8.iPSCは細胞リプログラミング技術のマイルストーンであり、細胞移植の大きな可能性を秘めています。しかし、不完全に分化した細胞からの腫瘍形成のリスクについては、依然として懸念がある。細胞移植のための代替細胞源は、不安定な中間体から導き出すことができる誘導神経幹細胞(iNSC)などの直接リプログラミングを通じて得られた系統コミット成人幹細胞であり、多能性をバイパスするステージ9,10,11.
iPSCとiNsCの両方は、線維芽細胞、末梢血単核細胞(PBMcNC)および様々な他のタイプの細胞12、13、14などの自家細胞源から再プログラムすることができ、したがって、移植細胞の免疫原性を大いに高める。さらに、iPSCと比較して、iNSCは腫瘍形成および系統コミット可塑性のリスクが減少し、ニューロンおよびグリア11に区別することができるだけである。初期研究では、ヒトまたはマウスのiPSCおよびiNSCは、侵襲的処置14、15である皮膚生検から得られた線維芽細胞から生成された。これに関して、PBMNCは、侵襲性の低いサンプリングプロセスのため魅力的なスターター細胞源であり、拡張時間16の短い期間内に多数の細胞を得ることが容易である。初期のリプログラミング研究では、レンチウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどの統合デリバリーシステムを採用し、多くのタイプの細胞で効率的かつ簡単に実装できます17;しかしながら、これらの送達システムは、残留トランスジーンの変異および再活性化を引き起こす可能性があり、これは臨床治療目的12の安全性問題を提示する。センダイウイルス(SeV)は、宿主ゲノムに統合されない負感のある一本鎖ゲノムを持つ非統合型RNAウイルスであるが、感染細胞の細胞質中にのみ複製し、リプログラミングのための効率的で安全な手段を提供する18 、19.組換えSeVベクトルは、オープンリーディングフレームにヒトOCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCを含む再プログラミング因子を含む利用可能です。 さらに、SeVウイルスベクターは、温度感受性変異を導入することによってさらに改善することができ、培養温度が39°C20に上昇したときに迅速に除去することができる。この記事では、SeV システムを使用して PBMC を iNsC に再プログラムするプロトコルについて説明します。
多くの研究は、様々な方法を使用してヒトESCまたはiPSCからDAニューロンの誘導を報告しています 6,8,21.しかし、iNSCからのDAニューロンの分化を詳細に説明するプロトコルが不足しています。このプロトコルでは、2段階法を用いてiNSCからのDAニューロンの効率的な生成について述べた。DAニューロン前駆体は、安全性および有効性評価のためのPDマウスモデルの線条体に移植することができる。本稿では、仙台ウイルスによる誘導神経幹細胞の生成、DAニューロンへのiNSCの分化、マウスPDモデルの確立、DA前駆体の線条体への移植まで、様々な段階をカバーする詳細なプロトコルを紹介する。PDモデルの。このプロトコルを使用して、患者や健康なドナーからiNSCを生成し、細胞移植の目的のために安全、標準化、スケーラブルで均質なDAニューロンを導き出したり、皿の中でPDをモデル化したり、メカニズムの調査を行うことができます。根本的な病気の発症と発症。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、PDモデルに対するiNSC-DA細胞療法の異なる段階をカバーするプロトコルを紹介した。このプロトコルの重要な側面は、(1)PBMNCの単離と拡大、SeV感染によるiNSCへのPBNCのリプログラミング、(2)INSCとDAニューロンの分化、(3)一方的な6-OHDA病変PDマウスモデルと行動の確立DA前駆体の細胞移植および行動評価
このプロトコルでは、最初の部分は、優先的にエリスロブラス…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、幹細胞と翻訳国家キープロジェクト(2016YFA0101403)、中国国立自然科学財団(81661130160、81422014、81561138004)、北京市自然科学財団(5142005)の助成金によって支援されました。北京タレント財団(201700021223TD03)、第13次5カ年計画(CIT&TCD20180333)、北京医療システムハイレベル人材賞(2015-3-063)の北京市立大学の高レベル教師支援プロジェクト市保健委員会基金(PXM 2018_026283_000002)、北京100、千、1万人の人材基金(2018A03)、北京市病院行政特別資金支援(ZYLX201706)、ロイヤル・ソサエティ・ニュートン・アドバンスト・フェローシップ(NA150482)。
Materials
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20℃ |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβⅢ | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor βⅢ |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
References
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