Enregistrement optique à grand champ à un seul photon dans des tranches de cerveau à l'aide de teinture sensible à la tension
Summary
Nous introduisons une méthode d’enregistrement optique reproductible et stable pour les tranches de cerveau à l’aide de colorant sensible à la tension. L’article décrit la coloration de colorant tension-sensible et l’enregistrement des signaux optiques utilisant les préparations conventionnelles de tranche hippocampal.
Abstract
L’imagerie à large champ de teinture sensible à la tension du photon (VSD) des préparations de tranches de cerveau est un outil utile pour évaluer la connectivité fonctionnelle dans les circuits neuronaux. En raison du changement fractionnaire dans le signal lumineux, il a été difficile d’utiliser cette méthode comme un essai quantitatif. Cet article décrit des systèmes spéciaux d’optique et de manipulation de tranches, qui rendent cette technique stable et fiable. Le présent article montre la manipulation de la tranche, la coloration et l’enregistrement des tranches hippocampales tachées de VSD en détail. Le système maintient des conditions physiologiques pendant une longue période, avec une bonne coloration, et empêche les mouvements mécaniques de la tranche pendant les enregistrements. En outre, il permet la coloration des tranches avec une petite quantité de colorant. L’optique atteint une ouverture numérique élevée à faible grossissement, ce qui permet l’enregistrement du signal VSD à la vitesse maximale de 10 kHz, avec une résolution spatiale de 100 pixels x 100 pixels. En raison de la fréquence de trame élevée et de la résolution spatiale, cette technique permet l’application des filtres post-enregistrement qui fournissent un rapport signal-bruit suffisant pour évaluer les changements dans les circuits neuronaux.
Introduction
L’imagerie à large champ de teinture sensible à la tension du photon (VSD) des préparations de tranches de cerveau tachées en vrac est devenue un outil quantitatif utile pour évaluer la dynamique des circuits neuronaux1,2,3,3 . Après l’analyse des changements dans les propriétés optiques dues à l’excitation de membrane5,6,7, l’imagerie VSD a été décrite pour la première fois au début des années 1970 par Cohen et d’autres6,8, 9. .; il s’agit d’une méthode appropriée pour surveiller les fonctions cérébrales en temps réel, car le colorant sonde directement les changements potentiels de la membrane (c.-à-d., le signal principal des neurones).
Les premiers VSD possédaient les caractéristiques souhaitables pour comprendre le système cérébral, comme un temps-constant rapide pour suivre la cinétique rapide des événements potentiels de membrane neuronale, et la linéarité avec le changement dans le potentiel de membrane9, 10 Ans et plus , 11 Ans, états-unis ( , 12 Ans, états-unis , 13 (en) , 14 (en) , 15. Semblable à d’autres expériences d’imagerie, cette technique nécessite un large éventail de accords spécifiques, tels que les caméras, l’optique, le logiciel et la physiologie des tranches, pour obtenir les résultats souhaités. En raison de ces écueils techniques, les avantages attendus au cours des efforts initiaux ne se sont pas nécessairement matérialisés pour la plupart des laboratoires qui ne se spécialisaient pas dans cette technique.
La cause première de la difficulté technique était la faible sensibilité du VSD vers le changement potentiel de membrane une fois appliqué à la coloration en vrac des préparations de tranche. L’ampleur du signal optique (c.-à-d. le changement fractionnaire de la fluorescence) est habituellement de 10-4-10-3 du signal de contrôle (F0) dans des conditions physiologiques. L’échelle temporelle du changement potentiel de membrane dans un neurone est d’environ millisecondes à quelques centaines de millisecondes. Pour mesurer les changements dans le potentiel membranaire du neurone, la caméra utilisée pour l’enregistrement devrait être en mesure d’acquérir des images à grande vitesse (10 kHz à 100 Hz). La faible sensibilité de VSD et la vitesse nécessaire pour suivre le signal neuronal nécessite une grande quantité de lumière à recueillir à la caméra à grande vitesse, avec un rapport signal-bruit élevé (S/N)2,16.
L’optique du système d’enregistrement est également un élément essentiel pour assurer la collecte de suffisamment de lumière et pour améliorer S /N. Le grossissement réalisé par l’optique est souvent excessivement faible, comme 1X à 10X, pour visualiser un circuit neuronal fonctionnel local. Par exemple, pour visualiser la dynamique du circuit hippocampique, un grossissement d’environ 5 serait approprié. Un tel grossissement faible a une faible efficacité de fluorescence; par conséquent, l’optique avancée serait bénéfique pour un tel enregistrement.
En outre, la physiologie de tranche est également essentielle. Étant donné que l’analyse d’imagerie exige que les tranches soient intactes, une manipulation soigneuse des tranches est nécessaire17. En outre, les mesures prises pour maintenir la viabilité de la tranche pour une plus longue période sont importantes18.
Le présent article décrit le protocole pour la préparation des tranches, la coloration VSD, et les mesures. L’article décrit également les améliorations apportées aux VSD, aux appareils d’imagerie et à l’optique, ainsi que d’autres améliorations supplémentaires au système expérimental qui ont permis d’utiliser cette méthode comme un test simple, puissant et quantitatif pour visualiser le modification des fonctions cérébrales19,20,21,22,23,24,25. La technique peut également être largement utilisée pour la potentialisation à long terme dans la zone CA1 des tranches hippocampal1. En outre, cette technique est également utile dans l’enregistrement optique des potentiels membranaires dans une seule cellule nerveuse26.
Protocol
Representative Results
Discussion
La physiologie de la tranche est essentielle pour recueillir le bon signal. L’utilisation du système de filtre à membrane d’anneau dans ce protocole garantit que la tranche reste saine et non déformée tout au long de la procédure2,16,17. D’autres systèmes peuvent être utilisés pour conserver la physiologie des tranches pendant l’enregistrement, mais la tranche ne doit pas se déformer à tout moment que l’imagerie a beso…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TT a reçu la subvention JSPS KAKENHI (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038, et JP15K00413) de MEXT et des subventions du Ministère de la Santé, du Travail et du Bien-être social (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] et H30 [18062156]). Nous tenons à remercier Editage (www.editage.jp) pour l’édition en anglais.
Materials
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM – Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/ 0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
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