Wide-fält Single-Photon optisk inspelning i hjärn skivor använda spännings känsliga Dye
Summary
Vi introducerar en reproducerbar och stabil optisk inspelnings metod för hjärn skivor med spännings känsligt färg ämne. Artikeln beskriver spännings känslig färg färgning och inspelning av optiska signaler med hjälp av konventionella Hippocampus slice preparat.
Abstract
Wide-fält enda Photon spännings känsliga färg ämne (VSD) avbildning av hjärnan slice preparat är ett användbart verktyg för att bedöma den funktionella anslutningen i neurala kretsar. På grund av den fraktionerad förändring i ljus signalen, har det varit svårt att använda denna metod som en kvantitativ analys. Den här artikeln beskriver speciella optik och segment hanterings system, som gör denna teknik stabil och pålitlig. Den nuvarande artikeln visar slice hantering, färgning och inspelning av VSD-färgade Hippocampus skivor i detalj. Systemet upprätthåller fysiologiska förhållanden under lång tid, med bra färgning, och förhindrar mekaniska rörelser av segmentet under inspelningarna. Dessutom, det möjliggör färgning av skivor med en liten mängd av färg ämnet. Optiken uppnår hög numerisk bländare vid låg förstoring, vilket möjliggör inspelning av VSD-signalen vid maximal bild hastighet på 10 kHz, med 100 pixel x 100-pixel rumslig upplösning. På grund av den höga bild hastighet och rumslig upplösning, denna teknik tillåter tillämpning av post-inspelningsfilter som ger tillräcklig signal-brus-förhållande för att bedöma förändringar i neurala kretsar.
Introduction
Wide-fält enda Photon spännings känsliga färg ämne (VSD) avbildning av bulk-betsad Brain slice preparat har blivit ett användbart kvantitativt verktyg för att bedöma dynamiken i neurala kretsar1,2,3,4 . Efter analysen av förändringar i optiska egenskaper på grund av membran excitation5,6,7, VSD Imaging beskrevs första gången i början av 1970-talet av Cohen och andra6,8, 9.; Det är en lämplig metod för att övervaka hjärnans funktioner i real tid som färg ämne direkt sonder membranet potentiella förändringar (dvs, den primära signalen för nerv celler).
De tidigaste VSDs besatt önskvärda egenskaper för att förstå hjärnans system, såsom en snabb tid-konstant att följa den snabba kinetiken av neuronala membran potentiella händelser, och linearitet med förändringen i membranet potential9, 10 , 11 för att , 12 av de , 13 det , 14 (på) , 15. liknar andra Imaging experiment, kräver denna teknik ett brett spektrum av specifika stämningar, såsom kameror, optik, program vara och slice fysiologi, för att uppnå önskat resultat. På grund av dessa tekniska fall gro par, de förväntade fördelarna under de första insatserna inte nödvändigt vis materialisera för de flesta av de laboratorier som inte specialiserade på denna teknik.
Den primala orsaken till den tekniska svårigheten var den låga känsligheten hos VSD mot membranet potentiell förändring när den tillämpas på bulk färgning av slice preparat. Storleken på den optiska signalen (dvs. fraktionerad förändring i fluorescens) är vanligt vis 10-4-10-3 av Control (F0) signal under fysiologiska förhållanden. Tids skalan för membranpotential förändring i en neuron är cirka millisekunder till några hundra millisekunder. För att mäta förändringar i neuronpotentialen i neuron, bör kameran som används för inspelningen kunna förvärva bilder med hög hastighet (10 kHz till 100 Hz). Den låga känsligheten hos VSD och den hastighet som krävs för att följa den neurala signalen kräver en stor mängd ljus som ska samlas på kameran med hög hastighet, med ett högt signal-brus-förhållande (S/N)2,16.
Optiken i inspelnings systemet är också en kritisk faktor för att säkerställa insamling av tillräckligt ljus och för att förbättra S/N. Förstoringen uppnås av optiken är ofta överdrivet låg, såsom 1X till 10X, för att visualisera en lokal funktionell neurala kretsen. Till exempel, för att visualisera dynamiken i hippocampus kretsen, en förstoring av cirka 5 skulle vara lämplig. Sådan låg förstoring har låg fluorescens effektivitet; Därför skulle Avancerad optik vara fördelaktigt för sådan inspelning.
Dessutom är segmentfysiologi också viktigt. Eftersom bild analysen kräver att skivorna är intakta behövs noggrann segment hantering17. Dessutom är de åtgärder som vidtagits för att bibehålla segmentets lönsamhet under en längre tid viktiga18.
I den här artikeln beskrivs protokollet för beredning av skivor, VSD-färgning och mätningar. Artikeln beskriver också förbättringar av VSDs, Imaging Device, och optik, och andra ytterligare förfiningar till det experimentella systemet som har möjliggjort denna metod som skall användas som en enkel, kraftfull och kvantitativ analys för att visualisera modifiering av hjärnans funktioner19,20,21,22,23,24,25. Tekniken kan också användas i stor utsträckning för långsiktig potentiering i CA1 området av Hippocampus skivor1. Dessutom är denna teknik också användbar i optisk inspelning av membran potentialer i en enda nervcell26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Segmentfysiologi är avgörande för att samla in rätt signal. Användningen av ring membran filter systemet i detta protokoll säkerställer att segmentet förblir friskt och oförvrängt under hela proceduren2,16,17. Andra system kan användas för att behålla segmentfysiologi under inspelningen, men segmentet bör inte få deformeras när som helst eftersom bilden behöver varje del av segmentet för att vara felfri. Ring-m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TT mottog JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 och JP15K00413) från MEXT och bidrag från ministeriet för hälsa, arbete och välfärd (MHLW-Kagaku-ippan-H27 [15570760] och H30 [18062156]). Vi vill tacka Editage (www.editage.jp) för engelsk språkiga redigering.
Materials
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM – Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/ 0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R. Opacity changes in stimulated nerve. The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Tominaga, T., Ichikawa, M. Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. , (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. . Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
