الفلورة الكمية في الموقع التهجين (FISH) والفلورة المناعية (IF) من منتجات جينية محددة في الخلايا المصابة KSHV
Summary
نحن نصف بروتوكول باستخدام الفلورة في الموقع التهجين (FISH) لتصور RNAs الهربس الفيروسي متعددة داخل الخلايا البشرية المصابة lytically، إما في تعليق أو التمسك. يتضمن هذا البروتوكول تحديد كمية الفلورة التي تنتج نسبة النيوكليوسيتوبلازمية ويمكن تمديدها للتصور المتزامن للبروتينات المضيفة والفيروسية ذات الفلورة المناعية (IF).
Abstract
البصيرة الميكانيكية تصل من دراسة متأنية والقياس الكمي لRNAs محددة والبروتينات. يمكن التقاط المواقع النسبية لهذه الجزيئات الحيوية في جميع أنحاء الخلية في أوقات محددة مع الفلورة في الموقع التهجين (FISH) والفلورة المناعية (IF). أثناء عدوى فيروس الهربس الليتيك، يخطف الفيروس الخلية المضيفة للتعبير بشكل تفضيلي عن الجينات الفيروسية، مما يسبب تغييرات في مورفولوجيا الخلايا وسلوك الجزيئات الحيوية. وتتركز أنشطة اللتيك في المصانع النووية، وتسمى مقصورات النسخ المتماثل الفيروسي، والتي يمكن تمييزها فقط مع FISH وIF. هنا نقوم بوصف بروتوكول قابل للتكيف من الحمض النووي الريبي FISH وتقنيات IF لفيروس الهربس المرتبطبة بساركوما كابوسي (KSHV) الخلايا المصابة، على حد سواء الالتزام وتعليق. وتشمل الطريقة خطوات لتطوير oligonucleotides المضادة للشعور محددة، مزدوجة الحمض النووي الريبي الأسماك، RNA FISH مع IF، والحسابات الكمية من كثافة الفلورة. تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على أنواع الخلايا المتعددة، والخلايا غير المصابة، والخلايا الكامنة، والخلايا اللاتيكية، والدورات الزمنية، والخلايا المعالجة بمثبطات لتحليل الأنشطة الصدغية لـ RNAs محددة والبروتينات من كل من المضيف البشري و KSHV.
Introduction
في المرحلة اللاإحتيابية (النشطة)، تخطف فيروسات الهربس الخلية المضيفة، مما يسبب تغييرات في مورفولوجيا الخلايا وتوطين الجزيئات البيولوجية، لإنتاج الفيرونات. قاعدة العمليات هي النواة، حيث يتم تكرار الجينوم الفيروسي الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل وتعبئتها في قذيفة بروتين، ودعا كابسيد1. للبدء، يعبر الفيروس عن بروتيناته الخاصة، واختطاف الآلات المضيفة ومنع التعبير عن الجينات المضيفة غير الأساسية، وهي عملية تسمى تأثير إيقاف المضيف. يتم ترجمة غالبية هذا النشاط إلى محددة 4′,6-دياميديينو-2-فينيليندول (DAPI)-المناطق النووية الخالية من تسمى مقصورات النسخ المتماثل الفيروسي, تتألف من كل من البروتينات المضيفة والفيروسية, RNAs, والحمض النووي الفيروسي2. يتم إصلاح الخلية لتوفير مساحة وموارد لمقصورات النسخ المتماثل وبالتالي تجميع الغطاء الفيروسي. بمجرد خروج الكابسيد من النواة، فإن كيفية تغليف الكابسيد في السيتوبلازم لإنتاج جسيمات فيروسية مرتبطة بالغشاء، والمعروفة أيضًا باسم فيريون، غير واضحة. فهم التوطين والتحولات المكانية لكل من الجزيئات الحيوية المضيفة والفيروسية خلال المرحلة اللائوية يوفر رؤية ميكانيكية أعمق في ترتيب مقصورة النسخ المتماثل، وتأثير إيقاف المضيف، ومسار خروج الفيرون، وغيرها العمليات المتعلقة بالعدوى الفيروسية الهربسية والنسخ المتماثل.
حاليا أفضل طريقة للكشف عن ودراسة هذه التغييرات هو التصور من البروتينات وRNAs في الخلايا المصابة مع الفلورة المناعية (IF) والهجين الفلورسنت في الموقع (FISH)، على التوالي. استخدام مسار زمني مع هذه التقنيات يكشف عن توطين الجزيئات الحيوية في النقاط الرئيسية للمرحلة اللاتيك أو ببساطة، البيانات spatiotemporal. FISH وIF تكمل التقنيات البيوكيميائية الأخرى، مثل تثبيط عملية الخلوية (على سبيل المثال، تثبيط النسخ المتماثل الحمض النووي الفيروسي)، RT-qPCR (تفاعل البوليميراز سلسلة في الوقت الحقيقي)، تسلسل الحمض النووي الريبي، البقع الشمالية، الطيف الكتلي، النشاف الغربي، و تحليل إنتاج الحمض النووي الفيروسي، التي قد توفر صورة أكثر عالمية للأنشطة الخلوية.
قمنا بتطوير استراتيجيات الحمض النووي الريبي FISH لفحص منتجات الحمض النووي الريبي من جينات محددة وتحليل حسابي يحسب كميا نسبة النيوكليوسيتوبلازميك لمنتج جين معين. إعداد عينة, تعديلها من المنشورات السابقة من قبل Steitz والزملاء3,4, من السهل نسبيا ويمكن استخدامها لكل من الخلايا الملتصقة والمعلقة. البروتوكول أيضا قابل للتكيف للاستخدام المتزامن لاستراتيجيات الأسماك RNA متعددة (مزدوجة RNA FISH) أو RNA FISH مع استراتيجيات IF. إن وضع استراتيجية محددة للأسماك والأسماك أمر ينطوي على تحديات، ولكن الاقتراحات الرامية إلى تحسين النجاح مبينة. تحليل البيانات الموضحهنا هو كمية إذا تم استخدام الخرز الفلورسنت وعلامات قوية من حدود المقصورة ويقدم نظرة ثاقبة إضافية في الميكروغراف، البصيرة التي تزيل التحيز الملاحظة. تم تصميم البروتوكول المفصل لكل من الخلايا الكامنة والليسية المصابة بفيروس الهربس المرتبط بساركوما كابوسي (KSHV) ويمكن استخدامه مع الخلايا أو الخلايا غير المصابة بفيروسات الهربس الأخرى5. وتنطبق أساليب التكميم على الدراسات المتعلقة بالتحولات النووية أو إعادة التوطين بين المقصورات دون الخلوية في معظم الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن تكييف البروتوكول الموضح في هذا التقرير مع أنواع الخلايا المختلفة ويتضمن خطوات لسمك RNA وRNA FISH المزدوج مع IF باستخدام الأجسام المضادة الأولية أحادية النسيلة ومتعددة النسيلة. على الرغم من أن الشرائح المعدة عادة ما يتم تصويرها مع المجهر البؤري، يمكن إجراء التصوير مع مجهر STED (استنفاد الانب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جوناثان رودنفيلز، كازيميرز تكوفسكي، ويوهانا ب. ويذرز على المشورة بشأن تحليل البيانات. كما نشكر ج. هايوارد على الأجسام المضادة لـ SSB. وقد تم دعم هذا العمل بمنحة T32GM007223 وT32AI055403 من المعاهد الوطنية للصحة (إلى TKV) ومنحة NIH (CA16038) (إلى JAS). JAS هو محقق في معهد هوارد هيوز الطبي. تم استنساخ الأشكال 1-3 والجدول 1 بإذن من الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة بموجب ترخيص إسناد المشاع الإبداعي من المنشور التالي: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi’s Sarcoma-Associated يتأثر تراكم فيروس الهربس في البؤر النووية بالنسخ المتماثل للحمض النووي الفيروسي والحمض النووي النووي المتعدد الشفرة غير الشفرة الفيروسية. مجلة علم الفيروسات. 92 (13)، دوي: 10.1128/JVI.00220-18، (2018).
Materials
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
References
- Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production. Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).
- Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses. Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).
- Weinberg, R. A., Penman, S. Small molecular weight monodisperse nuclear RNA. Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).
- Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. Kaposi’s sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line. International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).
- Chiou, C. J., et al. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Nakamura, H., et al. Global changes in Kaposi’s sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator. Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).
- Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. Gene structure and expression of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59. Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).
- Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).
- Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), (2018).
- Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry. RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).
- Bruce, A. G., et al. Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells. Pathogens. 6 (1), (2017).
- Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. Journal of Virology. 91 (11), (2017).
