Fluorescence quantitative In Situ Hybridization (FISH) et Immunofluorescence (IF) de produits génétiques spécifiques dans les cellules infectées par le KSHV
Summary
Nous décrivons un protocole utilisant l’hybridation in situ de fluorescence (FISH) pour visualiser les ARN herpèsvirs multiples dans les cellules humaines lytically infectées, en suspension ou adhérentes. Ce protocole comprend la quantification de la fluorescence produisant un rapport nucléocytoplasmique et peut être étendu pour la visualisation simultanée des protéines hôtes et virales avec immunofluorescence (IF).
Abstract
La perspicacité mécanique provient d’une étude minutieuse et d’une quantification d’ARN et de protéines spécifiques. Les emplacements relatifs de ces biomolécules dans toute la cellule à des moments précis peuvent être capturés avec la fluorescence in situ hybridation (FISH) et l’immunofluorescence (IF). Pendant l’infection par l’herpèsvirus lytique, le virus détourne la cellule hôte pour exprimer de préférence les gènes viraux, provoquant des changements dans la morphologie cellulaire et le comportement des biomolécules. Les activités lytiques sont centrées dans les usines nucléaires, appelées compartiments de réplication virale, qui ne sont discernables qu’avec FISH et IF. Ici nous décrivons un protocole adaptable des techniques de FISH d’ARN et de IF pour kaposi’ s sarcoma-associé à l’herpèsvirus (KSHV)-infecté cellules, adhérentes et en suspension. La méthode comprend des étapes pour le développement d’oligonucléotides anti-sens spécifiques, DOUBLE ARN FISH, ARN FISH avec IF, et des calculs quantitatifs des intensités de fluorescence. Ce protocole a été appliqué avec succès à plusieurs types de cellules, cellules non infectées, cellules latentes, cellules lytiques, cours temporels, et cellules traitées avec des inhibiteurs pour analyser les activités spatiotemporal esdedeuses de RNA et de protéines spécifiques de l’hôte humain et Le KSHV.
Introduction
Dans leur phase lytique (active), les herpèsvirus détournent la cellule hôte, provoquant des changements dans la morphologie cellulaire et la localisation des molécules biologiques, pour produire des virions. La base des opérations est le noyau, où le génome viral de l’ADN à double brin est reproduit et emballé dans une coquille de protéine, appelée capside1. Pour commencer, le virus exprime ses propres protéines, détournant les machines hôtes et empêchant l’expression de gènes hôtes non essentiels, un processus appelé l’effet d’arrêt de l’hôte. La majorité de cette activité est localisée dans des régions nucléaires spécifiques, exemptes de réplication virale, composées de protéines hôtes et virales, d’ARNet d’ADN viral 2. La cellule est révisée pour fournir de l’espace et des ressources pour les compartiments de réplication et donc l’assemblage de capsides virales. Une fois que la capsite sort du noyau, la façon dont la capside est enveloppée dans le cytoplasme pour produire une particule virale liée à la membrane, également connue sous le nom de virion, n’est pas claire. La compréhension de la localisation et des changements spatiaux des biomolécules hôtes et virales pendant la phase lytique fournit un aperçu mécaniste plus profond de l’arrangement du compartiment de réplication, de l’effet d’arrêt de l’hôte, de la voie d’évacuation des virions et d’autres processus liés à l’infection et à la réplication de l’herpèsviral.
Actuellement, la meilleure méthode pour détecter et étudier ces changements est la visualisation des protéines et des ARN dans les cellules infectées avec immunofluorescence (IF) et l’hybridation in situ fluorescente (FISH), respectivement. L’utilisation d’un cours de temps avec ces techniques révèle la localisation des biomolécules à des points clés de la phase lytique ou tout simplement, des données spatiotemporales. FISH et IF complètent d’autres techniques biochimiques, telles que l’inhibition d’un processus cellulaire (p. ex., inhibition de la réplication virale de l’ADN), RT-qPCR (réaction en chaîne de polymérase en temps réel), séquençage de l’ARN, taches nordiques, spectrométrie de masse, ballonnements occidentaux et l’analyse de la production d’ADN viral, qui peut fournir une image plus globale des activités cellulaires.
Nous avons développé des stratégies RNA FISH pour examiner les produits à base d’ARN à partir de gènes spécifiques et une analyse computationnelle qui calcule quantitativement le rapport nucléocytoplasmique d’un produit génétique spécifique. La préparation de l’échantillon, modifiée à partir de publications antérieures par Steitz et ses collègues3,4, est relativement facile et peut être utilisé pour les cellules adhérentes et suspendues. Le protocole est également adaptable pour l’utilisation simultanée de plusieurs stratégies ARN FISH (double ARN FISH) ou RNA FISH avec des stratégies IF. L’élaboration d’une stratégie FISH spécifique est difficile, mais des suggestions pour améliorer le succès sont esquissées. L’analyse des données décrite ici est quantitative si des perles fluorescentes et des marqueurs solides des limites des compartiments sont utilisés et offre un aperçu supplémentaire des micrographes, un aperçu qui élimine les biais d’observation. Le protocole détaillé est conçu pour les cellules latentes et lytiques infectées par l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi (KSHV) et peut être utilisé avec des cellules non infectées ou des cellules infectées par d’autres herpèsvirus5. Les méthodes de quantitation s’appliquent aux études sur les décalages nucléocytoplasmiques ou la relocalisation entre les compartiments subcellulaires dans la plupart des cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit dans ce rapport peut être adapté à différents types de cellules et inclut des étapes pour le FISH et le FISH d’ARN doubles avec IF utilisant les anticorps primaires monoclonaux et polyclonal. Bien que les diapositives préparées soient généralement représentées à l’effile avec un microscope confocal, l’imagerie peut être réalisée avec un microscope STED (épuisement des émissions stimulées) après des modifications de la concentration accrue des anticorps et d’un milieu de montage dif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski et Johanna B. Withers pour leurs conseils sur l’analyse des données. Nous remercions également G. Hayward pour l’anticorps anti-SSB. Ce travail a été soutenu par des subventions T32GM007223 et T32AI055403 des National Institutes of Health (to TKV) et des NIH (CA16038) (à JAS). JAS est un chercheur du Howard Hughes Medical Institute. Les figures 1-3 et le tableau 1 ont été reproduits avec la permission de l’American Society for Microbiology sous une licence Creative Commons Attribution de la publication suivante : Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi’s Sarcoma-Associated L’accumulation d’ARNm d’herpèsvirus dans le foci nucléaire est influencée par la réplication virale d’ADN et l’ARN nucléaire polyadenylated de non-codage viral. Journal of Virology. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).
Materials
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
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