Quantitative Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll, das fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet, um mehrere herpesvirale RNAs in lytisch infizierten menschlichen Zellen zu visualisieren, entweder in Suspension oder anhaftend. Dieses Protokoll enthält die Quantifizierung der Fluoreszenz, die ein nukleozytoplasmatisches Verhältnis erzeugt, und kann für die gleichzeitige Visualisierung von Wirts- und viralen Proteinen mit Immunfluoreszenz (IF) erweitert werden.
Abstract
Mechanistische Erkenntnisse stammen aus einer sorgfältigen Untersuchung und Quantifizierung bestimmter RNAs und Proteine. Die relativen Positionen dieser Biomoleküle in der Zelle zu bestimmten Zeiten können mit Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) erfasst werden. Während einer lytischen Herpesvirus-Infektion entführt das Virus die Wirtszelle, um bevorzugt virale Gene auszudrücken, was zu Veränderungen in der Zellmorphologie und dem Verhalten von Biomolekülen führt. Lytische Aktivitäten konzentrieren sich auf Atomfabriken, die als Viralreplikationsfächer bezeichnet werden und nur mit FISH und IF erkennbar sind. Hier beschreiben wir ein anpassungsfähiges Protokoll von RNA FISH- und IF-Techniken für Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus-infizierte Zellen, sowohl anhaftend als auch in Suspension. Die Methode umfasst Schritte zur Entwicklung spezifischer Anti-Sense-Oligonukleotide, Doppel-RNA-FISH, RNA-FISH mit IF und quantitative Berechnungen von Fluoreszenzintensitäten. Dieses Protokoll wurde erfolgreich auf mehrere Zelltypen, nicht infizierte Zellen, latente Zellen, lytische Zellen, Zeitläufe und Zellen angewendet, die mit Inhibitoren behandelt wurden, um die räumlich-zeitlichen Aktivitäten bestimmter RNAs und Proteine sowohl vom menschlichen Wirt als auch von Proteinen aus dem menschlichen Wirt und KSHV.
Introduction
In ihrer lytischen (aktiven) Phase kapern Herpesviren die Wirtszelle, was zu Veränderungen in der Zellmorphologie und Lokalisierung biologischer Moleküle führt, um Virionen zu erzeugen. Die Operationsbasis ist der Kern, in dem das doppelsträngige DNA-Virusgenom repliziert undin eine Proteinhülle, Capsid 1, verpackt wird. Zu Beginn drückt das Virus seine eigenen Proteine aus, entführt Wirtsmaschinen und verhindert die Expression von nicht-essentiellen Wirtsgenen, ein Prozess, der als Wirtsabschalteffekt bezeichnet wird. Der Großteil dieser Aktivität ist lokalisiert auf spezifische 4-,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)-freie Kernregionen, die als Viralreplikationskompartimenten bezeichnet werden und aus Wirts- und Viralproteinen, RNAs und viraler DNA2bestehen. Die Zelle wird überholt, um Platz und Ressourcen für die Replikationsräume und damit die Montage von viralen Kapsiden bereitzustellen. Sobald das Capsid den Kern verlässt, ist unklar, wie das Capsid in das Zytoplasma eingehüllt wird, um ein membrangebundenes virales Teilchen zu produzieren, das auch als Virion bekannt ist. Das Verständnis der Lokalisierung und räumlichen Verschiebungen von Wirts- und viralen Biomolekülen während der lytischen Phase bietet tiefere mechanistische Einblicke in die Anordnung des Replikationsfachs, den Wirtsabschalteffekt, den Virion-Egress-Pfad und andere Prozesse im Zusammenhang mit herpesviralen Infektionen und Replikationen.
Derzeit ist die beste Methode, um diese Veränderungen zu erkennen und zu untersuchen, die Visualisierung von Proteinen und RNAs in infizierten Zellen mit Immunfluoreszenz (IF) bzw. fluoreszierender In-situ-Hybridisierung (FISH). Die Verwendung eines Zeitverlaufs mit diesen Techniken zeigt die Lokalisierung von Biomolekülen an zentralen Punkten der lytischen Phase oder einfach, raumzeitliche Daten. FISH und IF ergänzen andere biochemische Techniken, wie z. B. Hemmung eines zellulären Prozesses (z. B. Hemmung der viralen DNA-Replikation), RT-qPCR (Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion), RNA-Sequenzierung, Nordflecken, Massenspektrometrie, Western Blotting und Analyse der viralen DNA-Produktion, die ein globaleres Bild der zellulären Aktivitäten liefern kann.
Wir entwickelten RNA-FISH-Strategien, um die RNA-Produkte aus bestimmten Genen zu untersuchen, und eine Rechneranalyse, die das nukleozytoplasmatische Verhältnis eines bestimmten Genprodukts quantitativ berechnet. Die Probenvorbereitung, modifiziert aus früheren Veröffentlichungen von Steitz und Kollegen3,4, ist relativ einfach und kann sowohl für Haftzellen als auch für suspendierte Zellen verwendet werden. Das Protokoll ist auch für den gleichzeitigen Einsatz mehrerer RNA FISH-Strategien (Double RNA FISH) oder RNA FISH mit IF-Strategien anpassungsfähig. Die Entwicklung einer spezifischen FISH-Strategie ist eine Herausforderung, aber es werden Vorschläge zur Verbesserung des Erfolgs skizziert. Die hier beschriebene Datenanalyse ist quantitativ, wenn fluoreszierende Perlen und starke Marker von Fachgrenzen verwendet werden und bietet zusätzliche Einblicke in die Mikrographen, Erkenntnisse, die Beobachtungsverzerrungen entfernen. Das detaillierte Protokoll ist sowohl für latente als auch für lytische Zellen konzipiert, die mit dem Mit dem Kaposi-Sarkat-assoziierten Herpesvirus (KSHV) infiziert sind, und kann mit nicht infizierten Zellen oder Zellen verwendet werden, die mit anderen Herpesviren infiziert sind5. Die Methoden der Quantifizierung sind auf Studien über nukleozytoplasmatische Verschiebungen oder Relokalisierung zwischen subzellulären Kompartimenten in den meisten Zellen anwendbar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das in diesem Bericht beschriebene Protokoll kann an verschiedene Zelltypen angepasst werden und enthält Schritte für doppel-RNA-FISH und RNA-FISH mit IF, wobei sowohl monoklonale als auch polyklonale Primärantikörper verwendet werden. Obwohl vorbereitete Dias in der Regel mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet werden, kann die Bildgebung mit einem STED-Mikroskop (stimulierte Emissionserschöpfung) nach Modifikationen der erhöhten Antikörperkonzentration und einem anderen Montagemedium durchgeführt werden. Zur …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski und Johanna B. Withers für die Beratung zur Datenanalyse. Wir danken auch G. Hayward für den Anti-SSB-Antikörper. Diese Arbeit wurde durch die Stipendien T32GM007223 und T32AI055403 von den National Institutes of Health (an TKV) und NIH Grant (CA16038) (an JAS) unterstützt. JAS ist ein Forscher des Howard Hughes Medical Institute. Die Abbildungen 1-3 und Tabelle 1 wurden mit Genehmigung der American Society for Microbiology unter einer Creative Commons Attribution Lizenz der folgenden Publikation reproduziert: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi es Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Akkumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018).
Materials
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
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