KSHV感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)と免疫蛍光(IF)における定量蛍光
Summary
我々は、その場ハイブリダイゼーション(FISH)における蛍光を利用して、凍結感染したヒト細胞内の複数のヘルペスウイルスRNAを懸濁または付着性のいずれかで可視化するプロトコルについて説明する。このプロトコルは、核細胞質比を産生する蛍光の定量を含み、免疫蛍光(IF)を有する宿主およびウイルスタンパク質の同時可視化のために拡張することができる。
Abstract
機械的な洞察は、特定のRNAおよびタンパク質の慎重な研究と定量から到着します。特定の時間における細胞全体のこれらの生体分子の相対的な位置は、その場ハイブリダイゼーション(FISH)および免疫蛍光(IF)における蛍光で捕捉することができる。溶解ヘルペスウイルス感染の間、ウイルスはウイルス遺伝子を優先的に発現するために宿主細胞をハイジャックし、細胞形態および生体分子の挙動に変化を引き起こす。溶解活性は、FISHとIFでのみ識別可能なウイルス複製コンパートメントと呼ぶ原子力工場を中心としています。ここでは、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)感染細胞に対するRNA FISHおよびIF技術の適応可能なプロトコルについて説明する。この方法には、特異的な抗感オリゴヌクレオチドの開発のためのステップ、ダブルRNA FISH、IFを有するRNA FISH、および蛍光強度の定量計算が含まれる。このプロトコルは、複数の細胞タイプ、未感染細胞、潜伏細胞、溶解細胞、時間コース、および阻害剤で処理された細胞に正常に適用され、ヒト宿主およびタンパク質の両方から特定のRNAおよびタンパク質の時空間的活性を分析し、KSHV
Introduction
その溶解性(活性)相において、ヘルペスウイルスは宿主細胞をハイジャックし、細胞形態の変化および生体分子の局在化を引き起こし、ビリオンを産生する。操作のベースは核で、二本鎖DNAウイルスゲノムが複製され、カプシド1と呼ばれるタンパク質シェルに包まれます。まず、ウイルスは独自のタンパク質を発現し、宿主機構を乗っ取り、非必須の宿主遺伝子の発現を防止し、宿主の遮断効果と呼んだプロセスである。この活性の大部分は、宿主およびウイルスタンパク質、RNA、およびウイルスDNA2の両方からなるウイルス複製コンパートメントと呼ばれる特定の4’、6-ジアミド-2-フェニリンドール(DAPI)フリー核領域に局在する。セルは、複製コンパートメントのスペースとリソースを提供し、ウイルスカプシドの組み立てに対して、オーバーホールされます。いったんカプシドが核から出ると、細胞質にカプセル化して膜結合型ウイルス粒子(ビリオンとも呼ばれる)を作り出す方法は不明である。溶解期における宿主とウイルス生体分子の両方の局在化と空間シフトの理解は、複製コンパートメントの配置、宿主の遮断効果、ビリオン出口経路、およびその他の機械的洞察を提供します。ヘルペスウイルス感染および複製に関連するプロセス。
現在、これらの変化を検出して研究する最良の方法は、免疫蛍光(IF)と蛍光を有する感染細胞におけるタンパク質およびRNAの可視化(FISH)である。これらの技術を用いたタイムコースの使用は、溶解相の重要な点または単に時空間的なデータにおける生体分子の局在を明らかにする。FISHおよびIFは、細胞プロセスの阻害(例えば、ウイルスDNA複製の阻害)、RT-qPCR(リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応)、RNAシーケンシング、ノーザンブロット、質量分析、ウェスタンブロッティングなどの他の生化学的技術を補完する。ウイルスDNA産生の分析は、細胞活動のよりグローバルな画像を提供する可能性があります。
特定の遺伝子からRNA産物を調べるRNA FISH戦略と、特定遺伝子産物の核細胞質比を定量的に計算する計算解析を開発した。Steitzたちは、Steitzたちは以前の出版物3,4から改変したサンプル調製物は比較的容易であり、付着細胞および懸濁細胞の両方に使用することができる。プロトコルはまたIFの戦略が付いている複数のRNA FISHの戦略(二重RNA FISH)またはRNA FISHの同時使用のために適応可能である。特定のFISH戦略の開発は困難ですが、成功を改善するための提案が概説されています。ここで説明するデータ分析は、蛍光ビーズとコンパートメント境界の強いマーカーを使用する場合に定量的であり、顕微鏡写真に関するさらなる洞察、観察バイアスを除去する洞察を提供します。詳細なプロトコルは、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)に感染した潜伏細胞および溶解細胞の両方のために設計されており、他のヘルペスウイルス5に感染した未感染細胞または細胞で使用することができる。定量の方法は、ほとんどの細胞の細胞下のコンパートメント間の核細胞シフトまたは再局在化に関する研究に適用可能である。
Protocol
Representative Results
Discussion
このレポートに記載されているプロトコルは、異なる細胞タイプに適応することができ、モノクローナルおよびポリクローナル一次抗体の両方を使用してIFを用いた二重RNA FISHおよびRNA FISHのステップが含まれる。調製されたスライドは、通常、共焦点顕微鏡で画像化されるが、画像化は、増加した抗体濃度および異なる取り付け媒体の修飾後にSTED(刺激放出枯渇)顕微鏡で行うことができる。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
データ分析に関するアドバイスをいただいたジョナサン・ローデンフェルス、カジミエシュ・ティコウスキー、ジョアンナ・B・ウィーザーズに感謝します。また、G.ヘイワードの抗SSB抗体に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(TKV)およびNIH助成金(CA16038)(JAS)からの助成金T32GM007223およびT32AI055403によって支援されました。JASはハワード・ヒューズ医学研究所の研究者です。図1-3および表1は、次の出版物からクリエイティブ・コモンズ・アトリビューション・ライセンスの下で米国微生物学会の許可を受けて複製されました:ヴァレリー、T.K.、ブリザーズ、J.B.、アンドー、J.A.、スタイツ、J.A.カポジの肉腫関連核病巣におけるヘルペスウイルスmRNA蓄積は、ウイルスDNA複製およびウイルス非コードポリアデデン化核RNAの影響を受ける。ウイルス学のジャーナル。92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018)
Materials
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
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