Adskillelse af Rotte Epidermis og Dermis med termolysin til at opdage site-specifikke inflammatoriske mRNA og protein
Summary
Præsenteret her er en protokol for adskillelse af epidermis fra dermis at evaluere inflammatoriske mægler produktion. Efter betændelse adskilles rotte hindpote epidermis fra dermis ved termolysin ved 4 °C. Epidermis bruges derefter til mRNA-analyse af RT-PCR og proteinevaluering af vestlig blot og immunohistochemistry.
Abstract
Brugervenlige og billige teknikker er nødvendige for at bestemme den stedsspecifikke produktion af inflammatoriske mæglere og neurotrophins under hudskade, betændelse og / eller sensibilisering. Formålet med denne undersøgelse er at beskrive en epidermal-dermal separationsprotokol ved hjælp af termolysin, en proteinase, der er aktiv ved 4 °C. For at illustrere denne procedure bedøves Sprague Dawley-rotter, og højre bagpote injiceres med carrageenan. Seks og tolv timer efter injektionen aflives rotter med betændelse og naive rotter, og et stykke bagpote, glabrous hud placeres i kold Dulbeccos Modificerede Eagle Medium. Epidermis adskilles derefter ved kældermembranen fra dermis ved termolysin i PBS med calciumchlorid. Dernæst er dermis sikret af mikrodissection pincet, og epidermis er forsigtigt drillet væk. Toluidinblå farvning af vævssektioner viser, at epidermis adskilles rent fra dermis i kældermembranen. Alle keratinocytcellelag forbliver intakte, og de epidermale rete-højderygge sammen med fordybninger fra dermal papillae observeres tydeligt. Kvalitativ og real-time RT-PCR bruges til at bestemme nerve vækstfaktor og interleukin-6 udtryk niveauer. Vestlige blotting og immunohistochemistry er endelig udført for at opdage mængder af nerve vækstfaktor. Denne rapport illustrerer, at kold termolysin fordøjelsen er en effektiv metode til at adskille epidermis fra dermis til vurdering af mRNA og protein ændringer under inflammation.
Introduction
Evaluering af inflammatoriske mæglere og neurotrofiske faktorer fra huden kan begrænses på grund af heterogeniteten af celletyper, der findes i den betændte dermis og epidermis1,2,3. Flere enzymer, kemiske, termiske eller mekaniske teknikker, der involverer adskillelse af de to lag eller til udførelse af celleafkobling til evaluering, er for nylig blevet gennemgået4. Syre, alkali, neutralt salt og varme kan opdele epidermis fra dermis hurtigt, men cellulær og ekstracellulær hævelse forekommer ofte5,6. Trypsin, pancreatin, elastase, keratinase, collagenase, pronase, dispase og termolysin er enzymer, der er blevet brugt til epidermal-dermal separation4,7. Trypsin og andre proteolytiske enzymer i bred skala er aktive ved 37-40 °C, men skal overvåges nøje for at forhindre dissociation af epidermale lag. Dispase kløver epidermis på lamina densa, men kræver 24 timer for adskillelse i kulden4,8 eller kortere tidspunkter ved 37 °C4,9. Et begrænsende træk ved alle disse teknikker er den potentielle forstyrrelse af vævsmorfologi og tab af integritet af mRNA og protein.
For at opretholde integriteten af mRNA og protein skal der udføres en hudadskillelsesmetode i kulden i en kort periode. Ved evaluering af hudsepareringsteknikker til betændelsesundersøgelser er termolysin et effektivt enzym til at adskille epidermis fra dermis ved kolde temperaturer4. Termolysin er aktiv ved 4 °C, kløver epidermale hemidesmosomer fra lamina lucida og adskiller epidermis fra dermis inden for 1-3 h4,8,10. Målet med denne rapport er at optimere brugen af termolysin til adskillelse af betændt rotte epidermis fra dermis til at opdage mRNA og proteinniveauer for inflammatoriske mæglere og neurotrofiske faktorer. Flere foreløbige rapporter er blevet præsenteret11,12,13,14,15. Formålet med dette manuskript er at beskrive en optimal hudadskillelsesteknik ved hjælp af termolysin og demonstrere påvisning af 1) markører for inflammation, 2) interleukin-6 (IL-6) mRNA og 3) nervevækstfaktor (NGF) mRNA og protein i epidermis af rotter med carrageenan-induceret inflammation (C-II)16,17. En foreløbig rapport ved hjælp af den komplette Freunds adjuvansmodel indikerer, at NGF mRNA og proteinniveauer stiger tidligt underinflammation 15. Hos mus forårsager hud sensibilisering med den aktuelle anvendelse af oxazolone en tidlig stigning i IL-6 mRNA ved hjælp af in situ hybridisering36. Både IL-6 og NGF har været impliceret i C-II18,19, men der har ikke været nogen rapporter, der beskriver mRNA eller proteinniveauer for IL-6 eller NGF specifikt fra epidermis i de akutte stadier af C-II.
Termolysinteknikken er billig og ligetil at udføre. Desuden giver termolysinadskillelse af epidermis fra dermis mulighed for mRNA, vestlig blot og immunohistokemisk analyse af inflammatoriske mæglere og neurotrofiske faktorer under betændelsesprocessen15. Efterforskere bør være i stand til nemt at bruge denne teknik i både prækliniske og kliniske undersøgelser af hudbetændelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Undersøgelsen fastslog, at epidermis af rotte bagpote glabrous hud let blev adskilt fra dermis ved hjælp af termolysin (0,5 mG/mL) i PBS med 1 mM calciumchlorid ved 4 °C i 2,5 timer. Histologiske evaluering viste, at epidermis var adskilt fra dermis i kælderen membranen, og at den epidermale rete kamme var intakte. Thermolysin er en ekstracellulær metalloendopeptidase produceret af Gram-positive (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24. Dens aktivitet er stabil ved 4 °C , men er…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieringen af denne forskning blev ydet af National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
References
- Choi, J. E., Di Nardo, A. Skin neurogenic inflammation. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K. Pathogenesis of psoriasis. Zeitschrift für Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. Structure-property relationship of skin. Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund’s Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation. Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
