Trennung von Rattenepidermis und Dermis mit Thermolysin zum Nachweis ortsspezifischer entzündlicher mRNA und Proteine
Summary
Hier wird ein Protokoll zur Trennung von Epidermis und Dermis vorgestellt, um die Produktion von Entzündungsmediatoren zu bewerten. Nach einer Entzündung wird die Hinterpfotenepidermis der Ratte durch Thermolysin bei 4 °C von der Dermis getrennt. Die Epidermis wird dann für die mRNA-Analyse mittels RT-PCR und die Proteinbewertung durch Western Blot und Immunhistochemie verwendet.
Abstract
Einfach anzuwendende und kostengünstige Techniken sind erforderlich, um die ortsspezifische Produktion von Entzündungsmediatoren und Neurotrophinen bei Hautverletzungen, Entzündungen und / oder Sensibilisierungen zu bestimmen. Ziel dieser Studie ist es, ein epidermal-dermales Trennungsprotokoll mit Thermolysin, einer Proteinase, die bei 4 °C aktiv ist, zu beschreiben. Um dieses Verfahren zu veranschaulichen, werden Sprague Dawley-Ratten betäubt und rechte Hinterpfoten mit Carrageen injiziert. Sechs und zwölf Stunden nach der Injektion werden Ratten mit Entzündungen und naive Ratten eingeschläfert, und ein Stück Hinterpfote, glabrous Haut wird in kalte Dulbeccos Modified Eagle Medium gelegt. Die Epidermis wird dann an der Basalmembran durch Thermolysin in PBS mit Calciumchlorid von der Dermis getrennt. Als nächstes wird die Dermis durch eine Mikrodissektionszette gesichert und die Epidermis sanft weggeteist. Toluidinblaue Färbungen von Gewebeschnitten zeigen, dass die Epidermis sauber von der Dermis an der Basalmembran getrennt ist. Alle Keratinozytenzellschichten bleiben intakt, und die epidermalen Rete-Grate zusammen mit Vertiefungen von dermalen Papillen werden deutlich beobachtet. Qualitative und Echtzeit-RT-PCR wird verwendet, um den Nervenwachstumsfaktor und die Interleukin-6-Expressionsniveaus zu bestimmen. Western Blotting und Immunhistochemie werden schließlich durchgeführt, um Mengen an Nervenwachstumsfaktor zu erkennen. Dieser Bericht zeigt, dass die kalte Thermolysinverdauung eine wirksame Methode ist, um Epidermis von Dermis zu trennen, um mRNA- und Proteinveränderungen während einer Entzündung zu bewerten.
Introduction
Die Beurteilung von Entzündungsmediatoren und neurotrophen Faktoren aus der Haut kann aufgrund der Heterogenität der Zelltypen in der entzündeten Dermis und Epidermis eingeschränkt sein1,2,3. Mehrere Enzyme, chemische, thermische oder mechanische Techniken, die die Trennung der beiden Schichten oder die Durchführung der Zelldissoziation zur Bewertung beinhalten, wurden kürzlich überprüft4. Säure, Alkali, neutrales Salz und Hitze können die Epidermis schnell von der Dermis trennen, aber zelluläre und extrazelluläre Schwellungen treten häufig auf5,6. Trypsin, Pankreatin, Elastase, Keratinase, Kollagenase, Pronase, Dispase und Thermolysin sind Enzyme, die zur epidermal-dermalen Trennung verwendet wurden4,7. Trypsin und andere breit angelegte proteolytische Enzyme sind bei 37–40 °C aktiv, müssen aber sorgfältig überwacht werden, um eine Dissoziation der epidermalen Schichten zu verhindern. Dispase spaltet die Epidermis an der Lamina densa, benötigt aber 24 h zur Trennung in den kalten4,8 oder kürzeren Zeitpunkten bei 37 °C4,9. Ein limitierendes Merkmal all dieser Techniken ist die mögliche Störung der Gewebemorphologie und der Verlust der Integrität von mRNA und Protein.
Um die Integrität von mRNA und Protein zu erhalten, sollte für kurze Zeit eine Hauttrennmethode in der Kälte durchgeführt werden. Bei der Bewertung von Hauttrenntechniken für Entzündungsstudien ist Thermolysin ein wirksames Enzym, um die Epidermis von der Dermis bei kalten Temperaturen zu trennen4. Thermolysin ist bei 4 °C aktiv, spaltet epidermale Hämidenmosomen aus der Lamina lucida und trennt die Epidermis innerhalb von 1–3 h4,8,10. Ziel dieses Berichts ist es, die Verwendung von Thermolysin zur Trennung der entzündeten Rattenepidermis von der Dermis zu optimieren, um mRNA- und Proteinspiegel für Entzündungsmediatoren und neurotrophe Faktoren nachzuweisen. Mehrere vorläufige Berichte wurden vorgelegt11,12,13,14,15. Das Ziel dieses Manuskripts ist es, eine optimale Hauttrenntechnik mit Thermolysin zu beschreiben und den Nachweis von 1) Entzündungsmarkern, 2) Interleukin-6 (IL-6) mRNA und 3) Nervenwachstumsfaktor (NGF) mRNA und Protein in der Epidermis von Ratten mit Carrageen-induzierter Entzündung (C-II)16,17zu demonstrieren. Ein vorläufiger Bericht unter Verwendung des vollständigen Freund-Adjuvansmodells zeigt, dass der NGF-mRNA- und Proteinspiegel während der Entzündung früh ansteigen15. Bei Mäusen führt die Hautsensibilisierung mit der topischen Anwendung von Oxazolon zu einem frühen Anstieg der IL-6 mRNA unter Verwendung der In-situ-Hybridisierung36. Sowohl IL-6 als auch NGF wurden in C-II18,19in Frage gestellt, aber es gab keine Berichte, die mRNA- oder Proteinspiegel für IL-6 oder NGF speziell aus der Epidermis während der akuten Stadien von C-II beschreiben.
Die Thermolysin-Technik ist kostengünstig und unkompliziert durchzuführen. Darüber hinaus ermöglicht die Thermolysintrennung der Epidermis von der Dermis die mRNA-, Western-Blot- und immunhistochemische Analyse von Entzündungsmediatoren und neurotrophen Faktoren während des Entzündungsprozesses15. Forscher sollten in der Lage sein, diese Technik sowohl in präklinischen als auch in klinischen Studien zu Hautentzündungen problemlos anzuwenden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Studie ergab, dass die Epidermis der glabrousen Hinterpfote der Ratte leicht von der Dermis mit Thermolysin (0,5 mG / ml) in PBS mit 1 mM Calciumchlorid bei 4 °C für 2,5 h getrennt werden konnte. Die histologische Auswertung ergab, dass die Epidermis an der Basalmembran von der Dermis getrennt war und dass die epidermalen Rete-Grate intakt waren. Thermolysin ist eine extrazelluläre Metalloendopeptidase, die von Gram-positivem (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24produziert w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung dieser Forschung wurde von den National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM) bereitgestellt.
Materials
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
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