前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成
Summary
前立腺腫瘍解剖に焦点を当て、マウス前立腺癌モデルの壊死および解剖の方法を示す。マウス前立腺腫瘍オルガノイドの生成のためのステップバイステッププロトコルも提示される。
Abstract
遺伝子を改変するための相同組換えに基づく方法は、生物学的研究を著しく進めている。遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)は、哺乳類の発達と疾患を研究するための厳格な方法です。当研究室では、部位特異的Cre-loxP組換後システムと前立腺特異的プロモーターを用いて、1つまたは複数の腫瘍抑制遺伝子の発現を欠く前立腺癌(PCa)のいくつかのGEMMを開発しました。本稿では、マウス前立腺腫瘍の解剖に焦点を当てて、これらのPCa GEMMの壊死に対する我々の方法について説明する。過去10年間に開発された新しい方法は、三次元でインビトロで臓器系をモデル化する上皮由来細胞の培養を促進した。また、マウスPCa GEMMsから腫瘍オルガノイドを生成する3D細胞培養法についても詳しく述べる。前臨床癌研究は、2D細胞培養および細胞株由来または患者由来異種移植片モデルによって支配されてきた。これらの方法は腫瘍微小環境を欠き、前臨床試験でこれらの技術を使用する限界である。GEMMは、腫瘍形成と癌の進行を理解するために、より生理学的に関連しています。腫瘍オルガノイド培養は、腫瘍のアーキテクチャおよび細胞系統特性を要約するインビトロモデルシステムである。さらに、3D細胞培養法は、腫瘍細胞培養と比較して正常細胞の増殖を可能にし、2D細胞培養技術を用いてはほとんど不可能である。組み合わせて、前臨床試験におけるGEMMと3D細胞培養の使用は、がん生物学に対する理解を深める可能性を秘めています。
Introduction
1980年代後半以降、相同組換えによって遺伝子を改変する能力は、生物学的システム1の研究を大きく進めてきた。Cre-loxPのような誘導性、組織、または細胞特異的な組換えシステムおよび部位特異的組換え物は、時間的および空間的に2、3の両方の遺伝子改変に対する制御を容易にすることによって、高度な遺伝子研究を行っている。 4.これらの遺伝的戦略の組み合わせは、実験モデルシステム5、6、7の広い配列を作成しました。
遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)は、個々の遺伝子または遺伝子群が哺乳類の発達や疾患に与える影響を評価するための不可欠なツールです。前臨床癌研究において、GEMMは癌の発達、進行、および治療8を研究するための最も生理学的に関連する厳格な方法である。当研究室は、がんGEMMの生成と特徴付けに特化しています。
米国の男性の間で最も高く診断された非皮癌は前立腺癌(PCa)である。PCa患者の大半は、リスクの低い疾患と生存率が高いが、疾患が進行段階で診断されたり、標的ホルモン療法が積極的で治癒不可能なPCaに進行を誘導する場合、生存率は劇的に低下する。サブタイプ9,10.当研究室では、1つ以上の腫瘍抑制遺伝子の凝対性アセレルを利用したGEMMsを開発しました。前立腺上皮細胞のみで活性化されるプロバシンプロモーターの下流にクレ・レコンビネーゼを用いてトランスジーンを導入したため、腫瘍抑制遺伝子発現の組み換えおよび喪失が前立腺に特異的に起こる。12.我々はまた、Cre13を有する細胞において、Creおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)発現を欠く細胞においてトマト蛍光タンパク質発現を誘導するmT/mGと呼ばれるCreレポータートランスジーンを含むためにGEMMを飼育した。この方法の提示と我々の代表的な結果は、我々が我々の研究室で研究するGEMMを示しているが、このプロトコルは、任意のマウスモデルから前立腺癌オルガノイドを生成するために使用することができる。しかし、代表的な結果セクションで詳しく説明したように、特定の腫瘍特性が前立腺癌オルガノイド生成に最適であることを観察しました。
過去10年間で、上皮起源の組織から細胞を培養する新しい方法は、インビトロ14、15の器官系をモデル化する能力の著しい進歩をもたらした。「3D細胞培養」という用語は、オルガノイドの確立と維持に関わる技術に起因しており、一般に、臓器特異的細胞系統によって駆動される二次的なアーキテクチャを組み立てる細胞からなる構造として定義することができる。特性16.これらの新しい方法は、細胞が長期的な成長のために変換や不死化を必要としないという古典的な2D細胞培養とは異なります。したがって、正常細胞の3D培養物は、病気の細胞と比較することができる。これは、通常、正常な細胞対照培養が利用できないがん研究において特に有益です。さらに、オルガノイドは、適切に分化した細胞型を持つ二次組織アーキテクチャを自発的に形成し、2D細胞株よりもインビトロで癌を理解するより良いモデルシステムを作る17。当研究室では、PCa GEMMから分離した腫瘍問題から3Dオルガノイドラインを作成し、インビボデータを補完し、GEMMでは実現できない実験を行っています。
この記事では、明確なマウス前立腺葉と転移性病変の解剖を含む、PCa GEMMの完全な壊死のための書かれた視覚的なプロトコルを提示する。我々は、正常マウス前立腺上皮組織18からオルガノイドを導出するためのDrostらによって以前に発表されたプロトコルに基づいて、マウス前立腺腫瘍からオルガノイドを生成するためのステップバイステップの方法を説明し、示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
前立腺腫瘍解剖およびオルガノイド生成のためのプロトコル内の重要なステップ
非前立腺組織の除去とマウス前立腺腫瘍の微細な解剖は、非前立腺上皮細胞と正常前立腺上皮細胞の両方がオルガノイドを生成するので、癌オルガノイドの最適な生成のために重要である。特に固形前立腺腫瘍の場合、生存可能な細胞の数を減らす壊死組織による汚染を除去するために生存性腫?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、HAマウスのノギンFcまたはHAマウスRspo1-Fcのいずれかで安定してトランスフェクトHEK293細胞を提供してくれたスタンフォード大学のカルビン・クオ研究所に感謝したいと思います。また、彼の研究室で蛍光解剖顕微鏡にアクセスさせてくださったディーン・タン博士に感謝します。この研究は、国立がん研究所からD.W.G.にCA179907によってサポートされました。ロズウェルパーク総合癌センターの共有リソースは、国立衛生癌センター支援助成金CA016056によって支援されました。
Materials
| 0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10 % neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
- Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
- Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
- Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
- Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242 (2018).
- Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).
- Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
- Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. 암 연구학. 66 (16), 7889-7898 (2006).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
- Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
- Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
- Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
