LC-MCYMS 诊断碎裂过滤的天然产物发现: 微囊藻毒素分析的应用
Summary
诊断碎片过滤, 实现到 MZmine, 是一种优雅的, 采集后的方法, 筛选 LC-MMSMS 数据集的整个类别的已知和未知的天然产品。此工具搜索 msms 光谱, 以查找分析师定义为诊断整个类别化合物的产品离子和中性损耗。
Abstract
天然产物通常作为结构相似化合物的混合物而生物合成, 而不是单一的化合物。由于其共同的结构特点, 同一类别中的许多化合物经历了类似的 mmsms 碎裂, 并具有几个相同的产品离子和/或中性损失。诊断碎片过滤 (DFF) 的目的是通过筛选包含类特定产品离子和中性损耗的 mmsms 光谱的非目标 LC-MMS-MS 数据集, 有效地检测复杂提取物中给定类的所有化合物。该方法基于在开源 MZmine 平台内实现的 DFF 模块, 该模块要求在高分辨率质谱仪 (如四极 Orbitrap 或四极飞行时间质量) 上通过依赖数据的采集来分析样本提取物分析仪。这种方法的主要局限性是, 分析师必须首先定义哪些产品离子和/或中性损失是特定于目标类别的天然产品。DFF 允许随后在复杂的样品中发现所有相关的天然产品, 包括新的化合物。在这项工作中, 我们证明了 DFF 的有效性, 通过筛选提取物的铜绿小细胞石, 一个突出的有害藻类绽放导致蓝藻, 产生微囊藻。
Introduction
串联质谱 (mssms) 是一种广泛使用的质谱方法, 它涉及通过应用活化能 (如碰撞诱导离解 (cid)1) 来分离前体离子并诱导碎裂。离子碎片与其分子结构密切相关的方式。天然产物通常作为结构相似化合物的混合物进行生物合成, 而不是作为一种独特的化学物质2。因此, 属于同一生物合成类别的结构相关化合物通常具有关键的 mmsms 碎裂特性, 包括共享产品离子和/或中性损失。能够筛选复杂的样品中含有类特定产品离子和中性损耗的化合物, 这是检测整个类别化合物的有力策略, 有可能导致发现新的天然产品3,4 个,5,6. 几十年来, 在低分辨率仪器上进行中性损耗扫描和前体离子扫描等质谱方法使具有相同中性损耗的离子或产物离子被检测出来。但是, 在执行实验之前, 需要定义特定的离子或跃迁。由于高分辨率质谱仪在研究实验室中越来越流行, 复杂样品现在通常使用非目标采集 (DDA) 方法进行筛选。与传统的中性损耗和前驱离子扫描相比, 通过采集后分析7可以识别结构上相关的化合物。在这项工作中, 我们展示了一种我们开发的策略, 称为诊断碎片过滤 (dff)5,6, 一种直接和用户友好的方法来检测复杂矩阵中的整个类别的化合物。此 DFF 模块已实现到开源 MZmine 2 平台中, 并可通过下载 MZmine 2.38 或较新版本获得。DFF 允许用户有效地筛选 DDA 数据集的 msms 光谱, 其中包含产品离子和/或中性损耗, 可诊断为整个类别的化合物。DFF 的限制是典型的产物离子, 一类化合物的中性损耗必须由分析师定义。
例如, 在确定的60多个不同的富莫尼辛霉菌毒素中 ,每个都有一个三甲菌侧链, 产生一个m/z157.0142 (c6h5o5-) 产品离子[M-H]–离子4的碎裂。因此, 通过筛选包含突出的 msz157.0142 产品离子的 DDA 数据集中的所有 M/Z 光谱, 可以使用 DFF 检测样品中的所有假定富莫尼辛。同样, 通过筛选含有 79 9.9574 da (SO3) 3 的诊断中性损耗的 msms 光谱的 dda 数据集, 可以检测到硫化化合物。该方法也已成功地应用于检测新的循环肽5和含有色氨酸或苯基丙氨酸残留物6的天然产物。
为了证明 DFF 的有效性及其在 MZmine 平台10中的易用性, 我们将此方法应用于微囊藻毒素 (mc) 的分析;由淡水蓝藻 11、12、13产生的超过240种与结构有关的毒素。
最常见的报告氰基毒素是 Mc, 其中最常研究的是 MC-LR (亮氨酸 [L]/精氨酸 [R]) 同源物 (图 1)。Mc 是单环细胞非核糖体七肽, 由多个蓝藻属 (包括微囊藻、阿纳巴纳、诺斯托克和普兰克托特里克斯12,13) 进行生物合成。Mc 由5个常见残基和两个由 l-氨基酸占据的可变位置组成.几乎所有的 Mc 都有一个典型的β-氨基酸 3-氨基-9-甲氧基-2, 6, 8-三甲基-10-4, 6-二烯酸 (Ada) 残留在位置5 11。 Mcs 的 msms 碎裂途径得到了充分的描述14,15;ada 残渣负责突出的 m/z 产品离子, m/z 135.0803+ (c9h 11o +) 以及其他产品离子, 包括m/z 163.1114 + (c11h15) O+) (图 2)。使用这些诊断离子可以对存在的所有微囊藻进行非靶向 dda 数据集, 证明微囊藻毒素存在添加残留。
Protocol
Representative Results
Discussion
DFF 是一种直接和快速的检测整类化合物的策略, 尤其适用于天然产品化合物的发现。DFF 最重要的方面是为目标类化合物定义特定的 msms 碎片化标准。在这个具有代表性的例子中, DFF 被用来检测铜绿假单胞菌提取物中存在的所有含有 mcs 的 Ada 残留物。虽然绝大多数的 Mc 含有阿达残留物, 但这一位置的其他残留物已经知道, 特别是脱甲基和乙酰二甲基-阿达变种 19.不会使用规?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
提交人感谢 He进roscon (加拿大水文文化中心、滑铁卢大学) 提供了所研究的蓝藻养殖, 并感谢 Sahsan Abusharkh (Carleton 大学) 的技术援助。
Materials
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | – | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| 기타 | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
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