LC-MS/MS 진단 조각화 필터링을 통한 천연물 발견: Microcystin 분석을 위한 응용
Summary
MZmine으로 구현 된 진단 조각화 필터링은 알려지거나 알려지지 않은 천연 제품의 전체 클래스에 대 한 LC-MS/MS 데이터 집합을 화면에 제공 하는 우아한, 사후 획득 방식입니다. 이 도구는 분석가가 전체 화합물 클래스에 대 한 진단으로 정의 된 제품 이온 및/또는 중립 손실에 대 한 MS/MS 스펙트럼을 검색 합니다.
Abstract
천연 제품은 종종 단일 화합물 보다는 구조적으로 유사한 화합물의 혼합물로 서 생물 합성. 일반적인 구조적 특징으로 인해 동일한 클래스 내의 많은 화합물은 유사한 MS/MS 단편화를 겪고 있으며 여러 동일한 제품 이온 및/또는 중립 손실이 있습니다. 진단 조각화 필터링 (DFF)의 목적은 클래스 특정 제품 이온 및/또는 중성 손실이 포함 된 MS/MS 스펙트럼에 대 한 비 표적 LC-MS/MS 데이터 세트를 선별 하 여 복합 추출 물에서 주어진 클래스의 모든 화합물을 효율적으로 검출 하는 것입니다. 이 방법은 사중 극 자 Orbitrap 또는 사중 극 기 시간 질량과 같은 고해상도 질량 분석기에서 데이터 종속 수집을 통해 샘플 추출 물을 분석 해야 하는 오픈 소스 MZmine 플랫폼 내에 구현 된 DFF 모듈을 기반으로 합니다. 분석기. 이 접근법의 주된 한계는 분석가는 먼저 어떤 제품 이온 및/또는 중립 손실이 천연 제품의 표적 부류에 특정적이는가를 정의 해야 한다는 것입니다. DFF는 새로운 화합물을 포함 하 여 복잡 한 샘플 내에서 모든 관련 된 천연 제품의 후속 발견을 허용 합니다. 이 작업에서는 마이크로 cystins의 생산을 위해, 시아 노 박테리아를 유발 하는 저명한 유해한 조류 꽃 인 녹 농 균의 추출 물을 선별 하 여 dff의 효과를 입증 합니다.
Introduction
탠덤 질량 분 광 법 (MS/MS)은 충돌 유도 해리 (CID)1과 같은 활성화 에너지의 적용을 통해 전 구체 이온을 분리 하 고 분열을 유도 하는 것을 포함 하는 널리 사용 되는 질량 분석기 방법입니다. 이온 조각이 분자 구조와 밀접 하 게 연결 되는 방식. 천연 제품은 종종 단일 고유 화학 물질 보다는 구조적으로 유사한 화합물의 혼합물로 서 바이오 합성 된다2. 이와 같이, 동일한 생 합성 클래스의 일부인 구조적으로 관련 된 화합물은 종종 공유 제품 이온 및/또는 중성 손실을 포함 하 여 주요 MS/MS 단편화 특성을 공유 합니다. 클래스 특정 제품 이온 및/또는 중립 손실을 가진 화합물에 대 한 복잡 한 샘플을 스크린 하는 능력은 화합물의 전체 클래스를 검출 하는 강력한 전략, 잠재적으로 새로운 천연 제품의 발견으로 이어지는3, 4 , 5 , 6. 수십 년 동안 저해상도 계측기에서 수행 되는 중성 손실 스캔 및 전 구체 이온 스캐닝과 같은 질량 분석 방법은 동일한 중성 손실 또는 제품 이온을 가진 이온을 검출할 수 있습니다. 그러나, 특정 이온 또는 전이 실험을 수행 하기 전에 정의 될 필요가 있다. 고 분해능 질량 분석기가 연구 실험실에서 더 많이 사용 되 고 있는 것 처럼, 이제 복잡 한 샘플은 비 표적 데이터 종속 수집 (DDA) 방법을 사용해 일반적으로 선별 됩니다. 기존의 중성 손실 및 전 구체 이온 스캐닝과는 대조적으로, 구조적으로 관련 된 화합물은 획득 후 분석 (7)에 의해 식별 될 수 있다. 이 작업에서는 복잡 한 매트릭스 내에서 화합물의 전체 클래스를 감지 하는 스트레이트 포워드 및 사용자 친화적인 접근법 인 진단 조각화 필터링 (dff)5라고 하는 전략을 개발 했습니다. 이 DFF 모듈은 오픈 소스 MZmine 2 플랫폼에 구현 되 고 MZmine 2.38 또는 최신 버전을 다운로드 하 여 사용할 수 있습니다. DFF를 사용 하면 화합물의 전체 클래스에 대 한 진단 인 제품 이온 및/또는 중성 손실 (들)을 포함 하는 MS/MS 스펙트럼에 대 한 DDA 데이터 세트를 효율적으로 화면에 표시 할 수 있습니다. DFF의 제한은 특성 제품 이온 및/또는 화합물의 종류에 대 한 중립 손실은 분석가가 정의 해야 합니다.
예를 들어, 60 개 이상의 상이한 fumonisin 진 균 독 소는8,9 는 tricarballylic 측 쇄를 소유 하며,이는 m/z 157.0142을 생성 하 고,이를 통해 제품 이온 [M-H]– 이온4의 파편. 따라서 샘플의 모든 추정 된 fumonisins는 눈에 띄는 m/z 157.0142 제품 이온을 포함 하는 DDA 데이터 셋 내에서 모든 MS/ms 스펙트럼을 선별 하 여 dff를 사용 하 여 검출할 수 있습니다. 마찬가지로, 황산 화 화합물은 79.9574 Da (SO3)의 진단 중립 손실을 포함 하는 MS/ms 스펙트럼에 대 한 DDA 데이터 세트를 스크리닝 함으로써 검출 될 수 있다. 이러한 접근법은 또한 새로운 고리형 펩 티 드5 및 트립토판 또는 페닐알라닌 잔기6을 함유 하는 천연물을 검출 하는데 성공적으로 적용 되었다.
MZmine 플랫폼 (10) 내에서 dff의 효율성과 사용 편의성을 입증 하기 위해 마이크로 cystins (MCs) 분석에이 접근법을 적용 했습니다. 240의 클래스는 구조적으로 관련 된 독 소 민물 시아 노 박테리아에 의해 생산11,12,13.
가장 흔히 보고 되는 청색 증은 MCs로, MC-LR (류 신 [L]/아르기닌 [R])이 가장 자주 연구 되었습니다 (그림 1). MCs는 단 환 비 리보솜 헵 타 펩 티 드, 마이크로 시 티 스, Anabaena, nostoc 및 planktothrix12를포함 하는 다중 시아 노 박테리아에 의해 바이오 합성 된다. MCs는 5 개의 공통 잔기와 L-아미노산이 차지 하는 두 가지 가변 위치로 구성 됩니다. 거의 모든 MCs는 위치 511에서 특징적인 β-아미노산 3 아미노 9 메 톡 시 2, 트리메 틸, 6 dienoic 산 (다이) 잔류물을가지고 있다. MCs의 ms/ms 단편화 경로는 잘 설명 된14,15; 다이 잔여물은 ms/ms 제품 이온, m/z 135.0803+ ) 뿐만 아니라 다른 제품 이온(예: m/z 163.1114+ )에 대 한 책임 (그림 2) 비 표적화 된 DDA에 녹 농 세포 추출 물의 데이터 세트는 이러한 진단 이온을 사용 하 여 존재 하는 모든 microcystins에 대해 스크리닝 할 수 있으며, 마이크로 cystins에는 아 다 잔사가 있음을 부여 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
DFF는 화합물의 전체 클래스를 검출 하기 위한 간단 하 고 빠른 전략, 특히 천연 제품 화합물 발견에 대 한 관련. DFF의 가장 중요 한 측면은 화합물의 표적 클래스에 대 한 특정 MS/MS 단편화 기준을 정의 하는 것입니다. 이 대표적인 예에서, DFF는 아 녹 농 세포 추출 물에 존재 하는 MCs를 함유 하는 모든 다 잔류 물을 검출 하기 위해 사용 되었다. 대다수의 MCs에는 다이 잔기가 포함 되어 있지만,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 헤더로 시 온 (캐나다 피 코 로지컬 문화 센터, 워털루 대학교에서 공부한 시아 노 박테리아 문화를 연구 하 고, 칼 턴 대학교)에 게 기술 지원을 제공 해 주셔서 감사 합니다.
Materials
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | – | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| 기타 | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
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