Фильтрация по диагностическим фрагментация, внедрен в МНА, представляет собой элегантный подход после приобретения для проверки наборов данных LC-MS/MS для целых классов как известных, так и неизвестных натуральных продуктов. Этот инструмент ищет MS/MS спектры для ионов продуктов и/или нейтральных потерь, которые аналитик определил как диагностические для всего класса соединений.
Натуральные продукты часто биосинтиразмерные как смеси структурно аналогичных соединений, а не одного соединения. Из-за их общих структурных особенностей, многие соединения в пределах одного класса проходят аналогичную фрагментация MS/MS и имеют несколько идентичных ионов продукта и/или нейтральных потерь. Целью диагностической фильтрации фрагментации (ДФФ) является эффективное обнаружение всех соединений данного класса в сложном экстракте путем скрининга нецелевых наборов данных LC-MS/MS для спектров MS/MS, содержащих специфические ионы продукта и/или нейтральные потери. Этот метод основан на модуле ДФФ, реализуем в рамках платформы с открытым исходным кодом ммпо, которая требует, чтобы образцы проб анализировались с помощью приобретения, зависимого от данных, от масс-спектрометра высокого разрешения, таких как четырехполюсный Орбитрапа или четырехполюсный период времени полета Анализаторы. Основным ограничением этого подхода является аналитик должен сначала определить, какие ионы продукта и/или нейтральных потерь являются специфическими для целевого класса натуральных продуктов. ДФФ допускает последующее обнаружение всех сопутствующих натуральных продуктов в рамках сложного образца, включая новые соединения. В этой работе мы демонстрируем эффективность ДФФ путем скрининга экстрактов aeruginosa, видного вредного цветения водорослей, вызывающего цианобактерии, для производства микроцистинов.
Тандем масс-спектрометрия (МС/МС) является широко используемым методом масс-спектрометрии, который включает изолирование ионного прекурсора и индуцирование фрагментации через применение энергии активации, например, индуцированной столкновением ДИССОЦИАЦИИ (СИД)1. Манера, в которой фрагменты ионов тесно связана с его молекулярной структурой. Натуральные продукты часто биосинтиразмерные как смеси структурно аналогичных соединений, а не как единое уникальное химическое вещество2. Таким образом, структурно связанные соединения, которые являются частью одного и того же биосинетического класса, часто разделяют основные характеристики фрагментации MS/MS, включая общие ионы продукта и/или нейтральные потери. Способность экрана сложных образцов для соединений, которые обладают класса конкретных ионов продукта и/или нейтральных потерь является мощной стратегией для выявления целых классов соединений, что потенциально приводит к открытию новых натуральных продуктов3, 4 , 5 , 6. на протяжении десятилетий массовые спектрометрии, такие как сканирование нейтральных потерь и сканирование ионов-прекурсоров на аппаратурах с низким разрешением, позволили обнаружить ионы с одинаковой нейтральной потерей или ионами продукта. Однако, специфические ионы или переходы необходимо определить до выполнять эксперименты. Как масс-спектрометры с высоким разрешением стали более популярными в исследовательских лабораториях, сложные образцы теперь обычно проверяются с использованием нецелевых, зависимых от данных методов приобретения (ДВР). В отличие от традиционных нейтральных потерь и сканирования ионов-прекурсоров, структурно связанные соединения могут быть идентифицированы по послеприобретному анализу7. В этой работе, мы демонстрируем стратегию, которую мы разработали называется диагностическая фрагментация фильтрации (ДФФ)5,6, прямой и удобный подход, чтобы обнаружить целые классы соединений в сложных матриц. Этот модуль ДФФ был реализован на платформе с открытым исходным кодом, Мммин 2 и доступен, загрузив 2,38 мин или новых релизов. ДФФ позволяет пользователям эффективно экран DDA наборы для MS/MS спектры, которые содержат продукт Ион (ы) и/или нейтральных потерь (ES), которые являются диагностическими для целых классов соединений. Ограничением ДФФ являются характерные ионы продукта и/или нейтральные потери для класса соединений, которые должны определяться аналитиком.
Например, каждый из более чем 60 различных микотоксина идентифицировали8,9 обладают трикарбаллиевой боковой цепью, которая генерирует m/z 157,0142 (C6H5O5–) продукт Ион на Фрагментация [M-H]– Ion4. Таким образом, все предполагаемые фумонилины в образце могут быть обнаружены с помощью ДФФ путем скрининга всех спектров MS/MS в наборе данных ДВР, которые содержат видный m/z 157,0142 продукт Ион. Аналогичным образом, Сульфированный соединений могут быть обнаружены путем скрининга наборов данных ДВР для MS/MS спектры, которые содержат диагностические нейтральной потери 79,9574 Da (SO3)3. Этот подход также был успешно применен для обнаружения новых циклических пептидов5 и натуральных продуктов, содержащих триптофан или фенилаланин остатков6.
Для того чтобы продемонстрировать эффективность ДФФ и его простоту использования в рамках платформы Ммммин10, мы применили этот подход к анализу микроцистинов (МС); класс из более чем 240 структурно связанных токсинов, производимых пресноводной цианобактерий11,12,13.
Наиболее часто сообщаемых цианотоксинов являются МС, с MC-LR (лейцин [L]/аргинин [R]) конгенер чаще всего изучал (рис. 1). МС-Моноцикл, не-рибосомальных гептапептиды, биосинтроразмерный многочисленными цианобактерий, включая Микроциды, Анабаена, Nostoc, и Планктотрикс12,13. МС состоят из пяти распространенных остатков и двух переменных позиций, занимаемых L-аминокислотами. Почти все МС обладают характерной b-аминокислотой 3-амино-9-метокси-2, 6, 8-триметил-10-фенилдека-4, 6-диеновая кислота (Адда) остаток в положении 511. МС/МС фрагментация пути МС хорошо описаны14,15; остаток Adda ответственн для видно MS/MS продукт Ион, m/z 135,0803+ (C9H11O+) также, как другие ионы продукта включая m/z 163,1114+ (C11H15 O+) (рис. 2). Нецелевые наборы данных ДВР aeruginosa клеточных экстрактов могут быть проверены на все микроцистины, присутствующие с помощью этих диагностических ионов, предоставляемые микроцистины имеют остаток Adda.
ДФФ является прямым и быстрая стратегия для обнаружения целых классов соединений, особенно актуально для природного продукта соединения открытия. Наиболее важным аспектом ДФФ является определение конкретных критериев фрагментации МС/МС для целевого класса соединений. В этом репрезе…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Хизер Рошон (Канадский центр Фитологических культур, Университет Ватерлоо за предоставление изучаемых цианобактерий и Сасан Абушарх (Карлтонский университет) за техническую помощь.
Cyanobacteria | |||
Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
Software | |||
Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
LC-MS | |||
Q-Exactive Orbitrap | Thermo | – | Equipped with HESI ionization source |
1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
Solvents | |||
Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
기타 | |||
Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
Media | |||
MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
P(IV) metal solution, 5 mL | |||
Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |