Naturliga produkt Discovery med LC-MS/MS diagnostiska fragmentering filtrering: ansökan om Microcystin analys
Summary
Diagnostiska fragmentering filtrering, implementeras i MZmine, är en elegant, efter förvärvet strategi för att skärmen LC-MS/MS dataset för hela klasser av både kända och okända natur produkter. Detta verktyg söker MS/MS-spektra för produkt joner och/eller neutrala förluster som analytikern har definierat som diagnostiskt för hela klassen av föreningar.
Abstract
Naturliga produkter är ofta biosyntetiseras som blandningar av strukturellt likartade föreningar, snarare än en enda förening. På grund av deras gemensamma strukturella egenskaper genomgår många föreningar inom samma klass liknande MS/MS-fragmentering och har flera identiska produkt joner och/eller neutrala förluster. Syftet med diagnostiska fragmentering filtrering (DFF) är att effektivt upptäcka alla föreningar av en viss klass i ett komplext extrakt genom screening icke-riktade LC-MS/MS dataset för MS/MS-spektra som innehåller klass specifika produkt joner och/eller neutrala förluster. Denna metod är baserad på en DFF modul som genomförs inom öppen källkod MZmine plattform som kräver prov extrakt analyseras av data beroende förvärv på en hög upplöst masspektrometer som fyrpolig Orbitrap eller fyrpolig tid-of-Flight Mass Analysatorer. Den huvudsakliga begränsningen av denna metod är att analytikern först måste definiera vilka produkt joner och/eller neutrala förluster som är specifika för mål klassen av natur produkter. DFF möjliggör efterföljande upptäckt av alla relaterade natur produkter inom ett komplext prov, inklusive nya föreningar. I detta arbete, vi visar effektiviteten av DFF genom screening extrakt av Microcystis aeruginosa, en framträdande skadlig alg blomning orsakar cyanobakterier, för produktion av mikrocystins.
Introduction
Tandem masspektrometri (MS/MS) är en allmänt använd masspektrometri metod som innebär att isolera en föregångare Jon och inducera fragmentering via tillämpning av aktiverings energi såsom kollisionsinducerad DISSOCIATION (CID)1. Det sätt på vilket ett jonfragment är intimt knutet till dess molekyl ära struktur. Naturliga produkter är ofta biosyntetiseras som blandningar av strukturellt likartade föreningar snarare än som en enda unik kemisk2. Strukturellt besläktade föreningar som ingår i samma bio syntetiska klass delar ofta viktiga MS/MS-fragmenteringsegenskaper, inklusive delade produkt joner och/eller neutrala förluster. Möjligheten att skärmen komplexa prover för föreningar som besitter klass-specifika produkt joner och/eller neutrala förluster är en kraftfull strategi för att upptäcka hela klasser av föreningar, vilket kan leda till upptäckten av nya naturliga produkter3, 4 för att , 5 den femte , 6. i årtionden har masspektrometri metoder såsom neutral förlust skanning och föregångare Jon skanning utförs på lågupplösta instrument har tillåtit joner med samma neutral förlust eller produkt joner att upptäckas. Men de specifika joner eller över gångar som måste definieras innan du utför experimenten. Som hög upplöst masspektrometrar har blivit mer populärt i forsknings laboratorier, är komplexa prover nu ofta screenas med icke-riktade, data-beroende förvärv (DDA) metoder. I motsats till traditionell neutral förlust och föregångare Jon skanning, kan strukturellt besläktade föreningar identifieras genom analys efter förvärvet7. I detta arbete visar vi en strategi som vi har utvecklat kallas diagnostiska fragmentering filtrering (DFF)5,6, en rak-forward och användarvänlig metod för att upptäcka hela klasser av föreningar inom komplexa matriser. Den här DFF modul er blitt genomfört in i öppen-källa, MZmine 2 plattform och tillgänglig vid data överföring MZmine 2,38 eller nye befriar. DFF tillåter användare att effektivt skärm DDA dataset för MS/MS Spectra som innehåller produkt Jon (s) och/eller neutral förlust (er) som är diagnostiska för hela klasser av föreningar. En begränsning av DFF är karakteristiska produkt joner och/eller neutrala förluster för en klass av föreningar måste definieras av analytikern.
Till exempel, var och en av de mer än 60 olika fumonisin mykotoxiner identifierade8,9 besitter en tricarballylic sido kedja, som genererar en m/z 157,0142 (C6H5O5–) produkt Jon på fragmenteringen av [M-H]– Ion4. Därför kan alla förmodade fumonisiner i ett prov detekteras med hjälp av DFF genom att screening alla MS/MS-spektra i en dda dataset som innehåller den framstående m/z 157,0142 produkt Ion. Likaså kan sulferade föreningar detekteras genom screening DDA dataset för MS/MS Spectra som innehåller en diagnostisk neutral förlust av 79,9574 da (SO3)3. Detta tillvägagångs sätt har också framgångs rikt tillämpats för att upptäcka nya cykliska peptider5 och naturliga produkter som innehåller tryptofan eller fenylalaninrester6.
För att demonstrera effektiviteten av DFF och dess användar vänlighet inom MZmine-plattformen10, har vi tillämpat denna metod för analys av microcystiner (MCS); en klass på över 240 strukturellt besläktade gifter producerade av sötvatten cyanobakterier11,12,13.
De vanligaste rapporterade cyanotoxiner är mcs, med MC-LR (leucin [L]/arginin [R]) kongen mest studerade (figur 1). MCS är monocykliska icke-ribosomala heptapeptides, biosyntetiseras av flera cyanobakterier släkten inklusive Microcystis, Anabaena, nostoc, och Planktothrix12,13. MCs består av fem gemensamma rester och två rörliga positioner upptas av L-amino syror. Nästan alla MCs besitter en karakteristisk β-amino syra 3-amino-9-metoxi-2, 6, 8-Trimetyl-10-fenyldeca-4, 6-dienoic Acid (adda) rester vid position 511. MS/MS-fragmenteringsvägarna för MCS är väl beskrivna14,15. Adda rester är ansvarig för den framstående MS/MS produkt Jon, m/z 135,0803+ (C9H11O+) samt andra produkt joner inklusive m/z 163,1114+ (c11h15 O+) (bild 2). Icke-riktade dda dataset av Microcystis aeruginosa cellulära extrakt kan screenas för alla microcystiner närvarande med hjälp av dessa diagnostiska joner, beviljas att mikrocystins har en adda rester.
Protocol
Representative Results
Discussion
DFF är en rak-framåt och snabb strategi för att upptäcka hela klasser av föreningar, särskilt relevant för naturlig produkt sammansatta upptäckt. Den viktigaste aspekten av DFF är att definiera de specifika MS/MS-fragmenteringskriterierna för den aktuella klassen av föreningar. I detta representativa exempel användes DFF för att upptäcka alla adda rester som innehåller MCs som finns i ett M. aeruginosa Cellular-extrakt. Även om de allra flesta MCs innehåller en adda rester, har andra rester i de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Heather Roshon (kanadensiska Phycological Culture Centre, University of Waterloo för att ge cyanobakterier kulturen studerade och sawsan Abusharkh (Carleton University) för tekniskt bistånd.
Materials
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | – | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| 기타 | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
- Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
- Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
- Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
- Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -. C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
- Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828 (2016).
- Bartók, T., Szécsi, &. #. 1. 9. 3. ;., Szekeres, A., Mesterházy, &. #. 1. 9. 3. ;., Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
- Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
- Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
- Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
- Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
- Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710 (2006).
- Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
- Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
- Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
- Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097 (2014).
