In Vivo Forward Genetic Screen zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in Drosophila melanogaster
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll mit einem vorwärts genetischen Ansatz, um Mutanten zu überprüfen, die Neurodegeneration in Drosophila melanogasterzeigen. Es beinhaltet einen Klettertest, histologische Analysen, Genkartierung und DNA-Sequenzierung, um letztendlich neue Gene im Zusammenhang mit dem Prozess des Neuroprotektions zu identifizieren.
Abstract
Es gibt viel über den Beginn und das Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen zu verstehen, einschließlich der zugrunde liegenden Gene, die dafür verantwortlich sind. Das Forward-Genscreening mit chemischen Mutagenen ist eine nützliche Strategie für die Kartierung mutierter Phänotypen zu Genen zwischen Drosophila und anderen Modellorganismen, die konservierte Zellwege mit Menschen teilen. Wenn das mutierte Gen von Interesse in frühen Entwicklungsstadien von Fliegen nicht tödlich ist, kann ein Klettertest durchgeführt werden, um auf phänotypische Indikatoren für eine verminderte Gehirnfunktion, wie niedrige Kletterraten, zu überprüfen. Anschließend kann eine sekundäre histologische Analyse des Hirngewebes durchgeführt werden, um die neuroprotektive Funktion des Gens durch Bewertung von Phänendern der Neurodegeneration zu überprüfen. Gen-Mapping-Strategien umfassen meiotische und Mangel-Mapping, die auf diesen gleichen Assays verlassen können durch DNA-Sequenzierung gefolgt werden, um mögliche Nukleotid-Änderungen im Gen von Interesse zu identifizieren.
Introduction
Neuronen sind zum größten Teil post-mitotisch und unfähig,1,2zu teilen. Bei den meisten Tieren gibt es neuroprotektive Mechanismen, um diese Zellen während der gesamten Lebensdauer des Organismus zu erhalten, besonders im Alter, wenn Neuronen am anfälligsten für Schäden sind. Gene, die diesen Mechanismen zugrunde liegen, können bei Mutanten identifiziert werden, die Neurodegeneration aufweisen, einem phänotyptischen Indikator für den Verlust des Neuroprotektions, mit einem vorwärts genetischen Protokoll. Vorwärtsgenetische Siebe, die chemische Mutagene wie Ethylmethansulfonat (EMS) oder N-Ethyl-N-Nitrosourea (ENU) verwenden, sind aufgrund der zufälligen Punktmutationen, die sie induzieren, besonders nützlich, was zu einem von Natur aus unvoreingenommenen Ansatz führt, der Licht auf zahlreiche Genfunktionen in eukaryotischen Modellorganismen3,4,5 (im Gegensatz dazu erzeugt die Röntgenmutagenese DNA-Brüche und kann zu Einer Neuanordnung anstelle von Punktmutationen führen6).
Die gemeine Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein ideales Thema für diese Bildschirme aufgrund ihrer hohen Qualität, gut benoteten Genomsequenz, ihrer langen Geschichte als Modellorganismus mit hochentwickelten genetischen Werkzeugen und vor allem ihrer gemeinsamen Evolutionsgeschichte mit Menschen7,8. Ein begrenzender Faktor für die Anwendbarkeit dieses Protokolls ist die frühe Letalität, die durch die mutierten Gene verursacht wird, was Tests im Altervon 9Jahren verhindern würde. Bei nicht-tödlichen Mutationen ist jedoch ein Klettertest, der negative Geotaxis ausnutzt, eine einfache, wenn auch umfangreiche Methode zur Quantifizierung beeinträchtigter motorischer Funktionsfähigkeit10. Um eine ausreichende bewegungsmotorische Reaktivität zu zeigen, sind Fliegen auf neuronale Funktionen angewiesen, um die Richtung zu bestimmen, ihre Position zu spüren und die Bewegung zu koordinieren. Die Unfähigkeit von Fliegen, als Reaktion auf Reize ausreichend zu klettern, kann daher auf neurologische Defektehinweisen 11. Sobald ein bestimmter defekter Kletterphänotyp identifiziert ist, können weitere Tests mit einem sekundären Bildschirm wie der histologischen Analyse von Hirngewebe verwendet werden, um Neurodegeneration in kletterdefekten Fliegen zu identifizieren. Nachfolgende Genkartierung kann dann verwendet werden, um die genomische Region auf dem Chromosom zu enthüllen, das das defekte neuroprotektive Gen von Interesse trägt. Um den chromosomalen Bereich von Interesse einzugrenzen, kann eine meiotische Kartierung mit mutierten Fliegenlinien durchgeführt werden, die dominante Markergene mit bekannten Positionen auf dem Chromosom tragen. Die Markergene dienen als Bezugspunkt für die Mutation, da die Häufigkeit der Rekombination zwischen zwei Loci eine messbare Entfernung bietet, die verwendet werden kann, um die ungefähre Position eines Gens abzubilden. Schließlich erzeugt das Überschreiten der mutierten Linien mit Linien mit ausgewogenen Mängeln auf dem meiotisch kartierten chromosomalen Bereich von Interesse einen Komplementierungstest, bei dem das Gen von Interesse überprüft werden kann, wenn sein bekannter Phänotyp5exprimiert wird. Polymorphe Nukleotidsequenzen im identifizierten Gen, die möglicherweise zu veränderten Aminosäuresequenzen führen, können durch Sequenzierung des Gens und Vergleich mit der Drosophila-Genomsequenz ausgewertet werden. Die anschließende Charakterisierung des gens von Interesse kann das Testen zusätzlicher mutierter Allele, Mutationsrettungsexperimente und die Untersuchung zusätzlicher Phänotypen umfassen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forward genetische Screens in Drosophila waren ein effektiver Ansatz, um Gene zu identifizieren, die an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich altersabhängiger Neuroprotektion5,23,24, 25. Mit dieser Strategie gelang es uns, Brat als neuartiges neuroprotektives Gen zu identifizieren17.
Ein kritis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Besonders dankbar sind wir Dr. Barry Ganetzky, in dessen Labor der genetische Bildschirm durchgeführt wurde, der die Identifizierung und Charakterisierung von Brat als neuroprotektives Gen ermöglicht. Wir danken Dr. Steven Robinow für die freundlicherweise Bereitstellung der Sammlung von ENU-mutagenisierten Fliegen, die in dem in diesem Artikel vorgestellten genetischen Bildschirm verwendet werden. Wir danken den Mitgliedern des Ganetzky-Labors, Drs. Grace Boekhoff-Falk und David Wassarman für die hilfreichen Diskussionen während der gesamten Dauer dieses Projekts, Ling Ling Ho und Bob Kreber für technische Hilfe, Dr. Aki Ikeda für die Nutzung seiner Mikrotome-Anlage an der University of Wisconsin und Dr. Kim Lackey and the Optical Analysis Facility at the University of Alabama.
Materials
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is X20 |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1X | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24×60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 | |
References
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