Denne metoden er avhengig av injeksjon av 0,5 − 3 μL av oppløsning i thorax av voksen sebrafisk. Prosedyren leverer effektivt proteiner og kjemiske forbindelser inn i nærheten av sebrafisk hjerte uten å skade orgelet. Tilnærmingen er egnet for testing effekter av eksogene faktorer på ulike vev i hjertet.
Den voksne sebrafisk hjertet gir en kraftig modell i CARDIAC gjenfødelse forskning. Selv om styrken i dette systemet er basert på transgene tilnærminger, gir en rask levering av eksogene faktorer en komplementær teknikk i funksjonelle studier. Her presenterer vi en metode som er avhengig av administrasjon av noen mikroliter av løsningen i perikard hulrom uten å forårsake hjerteinfarkt skade. Intratorakal (IT) injeksjoner kan effektivt levere proteiner og kjemiske forbindelser direkte på hjertet overflaten. De injisert stoffene diffus gjennom epicardium inn i underliggende CARDIAC vev. Sammenlignet med intraperitoneal (IP) injeksjoner, den største fordelen med intratorakal injeksjoner er fokal administrasjon av testede faktorer på målet organ. Levering av molekyler direkte inn i pericardium er en egnet strategi for studier av CARDIAC preconditioning og regenerering i voksen sebrafisk.
Blant virveldyr har sebrafisk en bemerkelsesverdig evne til å regenerere sitt hjerte1,2. Denne evnen har blitt rapportert i flere skade modeller, nemlig ventrikkel Apex reseksjon, cryoinjury (CI) og genetisk cardiomyocyte ablasjon3,4, 5,6,7. Etter invasive skader, blir den skadede veggen av ventrikkel midlertidig helbredet av antifibrotiske vev, som er gradvis erstattet av en ny myokard8,9,10,11. Tidlig såret healing respons innebærer epicardium aktivering og rekruttering av immunceller12,13,14,15. Samtidig blir cardiomyocytes nær den skadde myokard aktivert, dedifferentiate, sprer og gradvis erstatter det skadede området innen 30 − 90 dager16,17,18, 19. betydelig fremgang i å tyde den molekylære og cellulære mekanismer for CARDIAC regenerering har blitt oppnådd takket være tilgjengeligheten av genetiske verktøy, for eksempel celle-avstamning tracing analyse, induserbart gen overuttrykte, fluorescerende vev reporter linjer, og CRISPR/Cas9 genet mutagenese20,21.
Vi har nylig etablert en modell av CARDIAC preconditioning i voksen sebrafisk ved toraktomi22,23. Preconditioning øker uttrykk for Kardioprotektive gener og hever re-entry inn i cellen syklus i intakt og regenererer hjerter. Disse prosessene er forbundet med rekruttering av immunceller og Matrix remodeling22,24. Mekanismene for preconditioning er dårlig forstått, og etablering av nye teknikker er nødvendig for å fremme dette området av forskning. Spesielt optimalisert administrasjon av utskilles signalering proteiner eller andre kjemiske forbindelser er avgjørende for å ytterligere undersøke dette emnet.
Å være akvatiske dyr, sebrafisk kan naturlig absorbere ulike stoffer oppløst i vann gjennom deres gjellene og hud. Dette gir en mulighet for ikke-invasiv legemiddellevering gjennom nedsenking av fisk i løsninger med ulike kjemikalier, slik som farmakologiske hemmere, steroid hormoner, Tamoxifen, BrdU og antibiotika. Faktisk, mange studier fra ulike laboratorier, inkludert vår25,26,27, har utnyttet denne metoden, som er spesielt verdifullt innen regenererende biologi6, 28. denne tilnærmingen er imidlertid ikke hensiktsmessig for levering av PEPTIDER, DNA, RNA, morpholinos eller molekyler med begrenset vev permeabilitet. I disse tilfellene er en mer effektiv levering oppnås ved microinjection inn i kroppen, for eksempel ved å sette inn kapillær i retro-orbital venøs sinus, i intraperitoneal eller intrapericardial hulrom29,30, 31i. Her beskriver vi en prosedyre for intratorakal injeksjon av en liten mengde løsning, som en egnet metode for å studere hjertet gjenfødelse og preconditioning i voksen sebrafisk.
Her beskriver vi en metode for å levere eksogene forbindelser og proteiner inn i perikard hulrom for å studere deres virkninger på hjertet i voksen sebrafisk. Prosedyren er basert på intratorakal injeksjon, noe som resulterer i levering av et lite volum av løsningen i nærheten av orgelet. Denne teknikken ble utviklet og beskrevet for å studere CARDIAC preconditioning og regenerering.
Det kritiske trinnet i denne prosedyren er inntrengning av glass kapillær inn i bryst hulen. Dette trinnet avhenger av tre parametre som er: stivhet og skarphet av kapillær spissen, vinkelen på penetrasjon, og punktering området. For å optimalisere inntrengning gjennom huden, bør den trakk delen av kapillær ikke å være for lang, som slike nåler er for fleksible og bøy i kontakt med huden. For å unngå dette, kan stivheten tilpasses ved å redusere spissen størrelse med iridektomi saks. Selv om vinkelen på penetrasjon kan variere mellom 30 ° og 45 °, kan det tilpasses til stivhet av spissen. Faktisk vil en tynn tupp trenge gjennom huden bedre med en smalere vinkel.
For å optimalisere nålen penetrasjon, bør innsetting området være rett over bankende hjerte. Risikoen for hjerte punktering er vanligvis lav varierer mellom 5% og 8%. Innsetting av nålen bakre til hjertet øker risikoen for hjerte punktering, sett av forbedret blødning. I slike tilfeller bør dyrene fjernes fra eksperimentene.
En annen kilde til problemer under IT-injeksjon skjer på kapillær nivå. Faktisk kapillær kan bryte når laterale krefter utøves på den. For å unngå dette, må nålen bevege seg langs aksen av injeksjon på en rett måte. Noen ganger kan kapillær blokkeres av vevs rester som hindrer væsken fra å strømme. Nålen kan oppheves ved forsiktig uttak av spissen mens sprøytebruk. Hvis dette ikke forbedrer flyten, anbefaler vi å trekke nålen fra thorax og erstatte nålen.
Lesjoner kan være forårsaket av en for dypt innsatt nål i pericardium. For å unngå lesjoner i perikard SAC, må nålen ikke settes inn for mye (1 − 2 mm) i thorax. Noen lekkasjer ble observert da injeksjonsvolumet var større enn 8 μL.
I sebrafisk er den eksakte sammensetningen av den perikard væsken ukjent. Imidlertid er volumet av perikard hulrom anslått til ~ 10 μL31. Gitt at volumet av den voksne sebrafisk ventrikkel er ca 1 − 2 mm3, antar vi at perikard hulrom Følgelig har et lite volum, som må vurderes før injeksjoner. Fra våre foreløpige studier har vi fastslått at det optimale spekteret av injisert volum er mellom 0,5 og 3 μL for fisk som måler 2,5 − 2,8 cm (avstand fra snute til caudal peduncle). Dette volumet kan tilpasses avhengig av størrelsen på fisken. Injeksjon på inntil 5 μL ikke indusere noen lesjon i fisken av denne størrelsen. Imidlertid var volumer fra 8 μL tilstrekkelige til å forårsake svulmende og indre blødninger som vist i figur 1F. Basert på disse dataene anslår vi at en mengde løsning som er større enn 3 μL kan forårsake fysisk og fysiologisk stress på orgelet. Denne begrensningen angir behovet for å velge en høyere konsentrasjon av molekyler i stedet for å øke mengden av injisert oppløsning.
En annen viktig faktor er den osmotisk eiendommen til injisert løsning, som bør være i det fysiologiske området. For å unngå risiko for osmotisk stress, anbefaler vi faktisk HBSS som injeksjons medium.
I sebrafisk, de vanligste metodene som brukes til å levere narkotika er gjennom vannbehandling og intraperitoneal injeksjon30,35. Selv om begge disse teknikkene er egnet for mange programmer, IT-injeksjoner gir eksperimentelle og økonomiske fordeler, ved å redusere risikoen for uønskede systemiske bivirkninger og redusere bruken av kostbare molekyler, henholdsvis. Denne metoden kan være egnet for levering av Tamoxifen for å aktivere grobunn-ERT2 transgene-systemet som brukes for celle avstamning tracing analyse, og guide modifisert RNAs for funksjonelle studier i regenerering forskning.
IT-injeksjon metoden i sebrafisk har tidligere blitt beskrevet31,36. I disse rapportene ble intratorakal injeksjoner utført med insulin nål, punktering fra fremre side. I kontrast presenterer vår protokoll en alternativ strategi med den trakk glass kapillær satt inn fra bakre retning. Spesielt vår tilnærming tar hensyn til anatomi av fisken pericardium å optimalisere injeksjon med en redusert risiko for hjerte punktering. Videre under prosedyren, er fisken ikke holdt av metallisk tang, men av en fuktig og myk svamp, som er en mer egnet metode for å unngå eventuelle ytre skader på fisken. Dermed presenteres metoden kan være bedre egnet for studier av hjerte homeostase, preconditioning og regenerering i voksen sebrafisk.
IT-injeksjoner har allerede blitt etablert i pattedyr modell organismer. Faktisk har denne metoden også blitt brukt i eksperimenter med griser og kliniske studier hos mennesker37,38. Hos mus har transthoracic intramyocardial injeksjoner styrt av ultrasounds blitt brukt til å utfordre deres hjerte39. I denne artikkelen foreslår vi en detaljert protokoll for å lette bruken av IT-injeksjon for sebrafisk. Dette vil være spesielt verdifullt for feltet, for å utfylle genetiske tilnærminger i hjertets homeostase, preconditioning og regenerering forskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker V. Zimmermann for utmerket teknisk assistanse og for fiske omsorg, D. König (Universitetet i Fribourg) for kritisk lesning av manuskriptet, D. Kressler (Universitetet i Fribourg) for hjelp med zCNTF proteinsyntese, F. Ruggiero (Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon) for å gi ColXII antistoff, og P. Martin (University of Bristol) for L-plastin antistoff. Vi takker Imaging Core anlegget og Proteomikk plattformen ved Universitetet i Fribourg. Dette arbeidet ble støttet av den sveitsiske National Science Foundation, gi nummer 310030_179213, og av schweizerische Herzstiftung (Swiss Heart Foundation).
Hanks Balanced Salt Solution | Gibco by Life technology | 14065-056 | |
Iridectomy scissor | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5602 | |
Macroscope (binocular) | M400 | with Apozoom | |
Micro-injector femtojet | Eppendorf | 5247 0034 77 | |
Microloaders femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
Micropipette glass needles type C | WPI | TW100F-6 | thin-wall capillary |
Micropipette puller model P-87 | Flaming/Brown | 20081016 | filament box 2.5 x 4.5 mm |
Sponge | any | any | dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm |
Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 | |
Dyes and Antibodies | Company | Catalog number | Comments |
anti-Chicken Cy5 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | Concentration: 1 / 500 | |
anti-Guinea pig Cy5 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | Concentration: 1 / 500 | |
anti-Rabbit Cy5 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | Concentration: 1 / 500 | |
Chicken l-plastin | gift from P. Martin, Bristol | Concentration: 1 / 1000 | |
DAPI | Sigma | 10236276001 | Concentration: 1 / 2000 (1µg/ml); 1/100 IT injected |
Guinea pig anti-ColXII | gift from Florence Ruggerio, Lyon | Concentration: 1 / 500 | |
Phalloidin-Atto-565 (F-actin) | Sigma | 94072 | Concentration: 1 / 500 |
Phalloidin-Atto-647 (F-actin) | Sigma | 95906 | Concentration: 1 / 50 IT injected |
Rabbit anti-MCM5 | gift from Soojin Ryu, Heidelberg | Concentration: 1 / 500 | |
Stamping Ink 4K | Pelikan | 1 4k 351 197 | Concentration: 1 / 1 |
ISH probe primers | |||
Cystatin | gene number: ENSDARG00000074425 fw primer: GATTCACTGTCGGGTTTGGG Rev primer: ATTGGGTCCATGGTGACCTC |