Summary

Analyse des interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation in vitro de bain

Published: August 23, 2019
doi:

Summary

Décrit ici est un protocole pour étudier les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain utilisant des systèmes de fermentation in vitro de lot.

Abstract

Les micro-organismes intestinaux humains sont récemment devenus une cible importante de la recherche dans la promotion de la santé humaine et la prévention des maladies. Par conséquent, les études sur les interactions entre les endobiotiques (p. ex., les médicaments et les prébiotiques) et le microbiote intestinal sont devenues un sujet de recherche important. Cependant, les expériences in vivo avec des volontaires humains ne sont pas idéales pour de telles études en raison de la bioéthique et des contraintes économiques. En conséquence, des modèles animaux ont été utilisés pour évaluer ces interactions in vivo. Néanmoins, les études de modèles animaux sont encore limitées par des considérations de bioéthique, en plus de compositions et de diversités différentes du microbiote chez les animaux par rapport aux humains. Une autre stratégie de recherche est l’utilisation d’expériences de fermentation par lots qui permettent d’évaluer les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal in vitro. Pour évaluer cette stratégie, les exopolysaccharides bifidobactériens (Bif) ont été utilisés comme xénobiotique représentatif. Ensuite, les interactions entre Bif EPS et le microbiote intestinal humain ont été étudiées à l’aide de plusieurs méthodes telles que la chromatographie à couches minces (TLC), l’analyse compositionnelle de la communauté bactérienne avec le séquençage à haut débit du gène rRNA 16S et la chromatographie gazeuse. d’acides gras à chaîne courte (SCFA). Présenté ici est un protocole pour étudier les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l’aide de systèmes de fermentation par lots in vitro. Fait important, ce protocole peut également être modifié pour étudier les interactions générales entre d’autres endobiotiques et le microbiote intestinal.

Introduction

Le microbiote intestinal joue un rôle important dans le fonctionnement des intestins humains et dans la santé de l’hôte. Par conséquent, le microbiote intestinal est récemment devenu une cible importante pour la prévention et la thérapie des maladies1. En outre, les bactéries intestinales interagissent avec les cellules intestinales hôtes et régulent les processus fondamentaux de l’hôte, y compris les activités métaboliques, les disponibilités nutritives, la modulation du système immunitaire, et même la fonction cérébrale et la prise de décision2,3 . Les endobiotiques ont un potentiel considérable pour influencer la composition bactérienne et la diversité du microbiote intestinal. Ainsi, les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain ont attiré l’attention croissante de la recherche4,5,6,7,8,9.

Il est difficile d’évaluer in vivo les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain en raison de la bioéthique et des contraintes économiques. Par exemple, des expériences sur les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain ne peuvent être réalisées sans la permission de la Food and Drug Administration, et le recrutement de volontaires coûte cher. Par conséquent, les modèles animaux sont souvent utilisés pour de telles enquêtes. Cependant, l’utilisation de modèles animaux est limitée en raison de différentes compositions de microbiotes et de la diversité dans les communautés associées aux animaux par rapport à l’homme. Une autre méthode in vitro pour explorer les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain est l’utilisation d’expériences de culture par lots.

Les exopolysaccharides (EPS) sont des prébiotiques qui contribuent de manière significative au maintien de la santé humaine10. Les EPS distincts qui se composent de différentes compositions et structures monosaccharides peuvent présenter des fonctions distinctes. Des analyses antérieures ont déterminé la composition des EPS Bif, qui sont le xénobiotique représentatif visé dans la présente étude11. Cependant, les effets métaboliques associés à l’hôte n’ont pas été pris en considération en ce qui concerne la composition et la diversité de l’EPS.

Le protocole décrit ici utilise le microbiote fécal de 12 volontaires pour fermenter les EPS Bif. La chromatographie à couches minces (TLC), le séquençage à haut débit du gène 16S rRNA et la chromatographie gazeuse (GC) sont ensuite utilisés en combinaison pour étudier les interactions entre les SPE et le microbiote intestinal humain. Les avantages distincts de ce protocole par rapport aux expériences in vivo sont son faible coût et l’évitement des effets d’interférence du métabolisme de l’hôte. En outre, le protocole décrit peut être utilisé dans d’autres études qui étudient les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain.

Protocol

Ce protocole suit les lignes directrices du comité d’éthique de l’Université des sciences et de l’ingénierie du Hunan (Hunan, Chine) et de l’Université Zhejiang Gongshang (Zhejiang, Chine). 1. Préparation des bactéries Préparation du bouillon bifidobacterium moyen Mélanger les composants suivants dans 950 ml d’eau distillée : extrait de viande, 5 g/L; extrait de levure, 5 g/L; peptone de caséine, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glucose, 10 g/L; K2HPO4…

Representative Results

La production d’EPS mucoid a pu être observée dans les cultures De B. longum sur les plaques PYG après incubation anaérobie pendant 72 h (figure 1A). La centrifugation des égratignures de culture, suivie des précipitations et du séchage de l’éthanol, a donné lieu à la collecte d’EPS semblables à la cellulose (figure 1B). L’EPS séché et l’amidon soluble ont ensuite été utilisés comme sources de carbone pour les cultures de fermentation. T…

Discussion

Des progrès significatifs ont été réalisés vers la compréhension de la composition et des activités du microbiote intestinal humain au cours de la dernière décennie. À la suite de ces études, le concept holobiont a émergé, qui représente les interactions entre les hôtes et les communautés microbiennes associées, comme entre les humains et leur microbiote intestinal19,20. En outre, les humains sont même maintenant considérés comme des super-org…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par la National Nature Science Foundation of China (no 31741109), la Hunan Natural Science Foundation (no 2018JJJ300) et le programme de construction de la discipline caractéristique appliquée à l’Université des sciences et de l’ingénierie du Hunan. Nous remercions LetPub (www.letpub.com) pour son aide linguistique lors de la préparation de ce manuscrit.

Materials

0.22 µm membrane filters Millipore SLGP033RB Use to filter samples
0.4-mm Sieve Thermo Fischer 308080-99-1 Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) Solarbio X1010 Use to prepare color plate
Acetic Sigma-Aldrich 71251 Standard sample for SCFA
Agar Solarbio YZ-1012214 The component of medium
Anaerobic chamber Electrotek  AW 400SG Bacteria culture and fermentation
Autoclave SANYO MLS-3750 Use to autoclave
Bacto soytone Sigma-Aldrich 70178 The component of medium
Baking oven Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd DHG-9240A Use to heat and bake
Beef Extract Solarbio G8270 The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter ATCC ATCC® 51870™ Bacteria
Bile Salts Solarbio YZ-1071304 The component of medium
Butyric Sigma-Aldrich 19215 Standard sample for SCFA
CaCl2 Solarbio C7250 Salt solution of medium
Capillary column SHIMADZU-GL InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) Used to SCFA detection
Casein Peptone Sigma-Aldrich 39396 The component of medium
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall ST 8 Use for centrifugation
CoSO4.7H2O Solarbio C7490 The component of medium
CuSO4.5H2O Solarbio 203165 The component of medium
Cysteine-HCl Solarbio L1550 The component of medium
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O Solarbio YZ-111614 The component of medium
Formic Acid Sigma-Aldrich 399388 Used to TLC
Gas chromatography Shimadzu Corporation GC-2010 Plus Used to SCFA detection
Glass beaker Fisher Scientific FB10050 Used for slurry preparation
Glucose Solarbio G8760 The component of medium
Haemin Solarbio H8130 The component of medium
HCl Sigma-Aldrich 30721 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric Sigma-Aldrich 46935-U Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids Sigma-Aldrich 129542 Standard sample for SCFA
K2HPO4 Solarbio D9880 Salt solution of medium
KCl Solarbio P9921 The component of medium
KH2PO4 Solarbio P7392 Salt solution of medium
LiCl.3H2O Solarbio C8380 Use to prepare color plate
Meat Extract Sigma-Aldrich-Aldrich 70164 The component of medium
Metaphosphoric Acid Sigma-Aldrich B7350 Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O Solarbio M8160 The component of medium
MgSO4.7H2O Solarbio M8300 Salt solution of medium
MISEQ Illumina MiSeq 300PE system DNA sequencing
MnSO4.H20 Sigma-Aldrich M8179 Salt solution of medium
Mupirocin Solarbio YZ-1448901 Antibiotic
NaCl Solarbio YZ-100376 Salt solution of medium
NaHCO3 Sigma-Aldrich 792519 Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000 NanoDrop Technologies ND-2000 Determine DNA concentrations
NaOH Sigma-Aldrich 30620 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol ChemSpider 71-36-3 Used to TLC
NiCl2 Solarbio 746460 The component of medium
Orcinol Sigma-Aldrich 447420 Used to prepare orcinol reagents
Propionic Sigma-Aldrich 94425 Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit QIAGEN 51504 Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A610100-0001 Used to prepare the lipid suspension
Resazurin Solarbio R8150 Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator LABCONCO CentriVap Use to prepare EPSs
Starch Solarbio YZ-140602 Use to the carbon source
Sulfuric Acid Sigma-Aldrich 150692 Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR BIO-RAD 1861096 PCR amplification
TLC aluminium sheets MerckMillipore 116835 Used to TLC
Trypticase Peptone Sigma-Aldrich Z699209 The component of medium
Tryptone Sigma-Aldrich T7293 The component of medium
Tween 80 Solarbio T8360 Salt solution of medium
Valeric Sigma-Aldrich 75054 Standard sample for SCFA
Vitamin K1 Sigma-Aldrich V3501 The component of medium
Vortex oscillator Scientific Industries Vortex.Genie2 Use to vortexing
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625 The component of medium
ZnSO4.7H2O Sigma-Aldrich Z0251 The component of medium

References

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Cite This Article
Hu, Y., Chen, H., Li, P., Li, B., Cao, L., Zhao, C., Gu, Q., Yin, Y. Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems. J. Vis. Exp. (150), e59725, doi:10.3791/59725 (2019).

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