यहाँ वर्णित इन विट्रो बैच किण्वन प्रणालियों में उपयोग endobiotics और मानव आंत microbiota के बीच बातचीत की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल है.
मानव आंतों सूक्ष्मजीवों हाल ही में मानव स्वास्थ्य को बढ़ावा देने और रोगों को रोकने में अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण लक्ष्य बन गए हैं. नतीजतन, एंडोबायोटिक्स (उदा., दवाओं और प्रीबायोटिक्स) और आंत माइक्रोबायोटा के बीच बातचीत की जांच एक महत्वपूर्ण अनुसंधान विषय बन गए हैं। हालांकि, मानव स्वयंसेवकों के साथ vivo प्रयोगों में bioethics और आर्थिक बाधाओं के कारण इस तरह के अध्ययन के लिए आदर्श नहीं हैं. नतीजतन, पशु मॉडल vivo में इन बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. फिर भी, पशु मॉडल अध्ययन अभी भी bioethics विचार द्वारा सीमित हैं, अलग रचनाओं और जानवरों बनाम मनुष्यों में microbiota की विविधताओं के अलावा. एक वैकल्पिक अनुसंधान रणनीति बैच किण्वन प्रयोगों का उपयोग है कि इन विट्रो में endobiotics और आंत microbiota के बीच बातचीत के मूल्यांकन की अनुमति है. इस रणनीति का मूल्यांकन करने के लिए, द्वि-विडोबैक्टीरियल (बिफ) एक्सोपॉलीसैकेराइड (ईपीएस) का उपयोग एक प्रतिनिधि विदेशीजीवी के रूप में किया गया था। फिर, Bif EPS और मानव आंत microbiota के बीच बातचीत पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी), जीवाणु समुदाय compositional विश्लेषण 16S rRNA जीन उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के साथ, और गैस क्रोमैटोग्राफी के रूप में कई तरीकों का उपयोग कर जांच की गई लघु श्रृंखला फैटी एसिड (SCFAs) की. यहाँ प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल endobiotics और मानव आंत microbiota इन विट्रो बैच किण्वन प्रणालियों में उपयोग के बीच बातचीत की जांच करने के लिए है. महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल भी अन्य endobiotics और आंत microbiota के बीच सामान्य बातचीत की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Gut microbiota मानव आंतों के कामकाज में और मेजबान स्वास्थ्य में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. नतीजतन, आंत microbiota हाल ही में रोग की रोकथाम और चिकित्सा1के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य बन गए हैं. इसके अलावा, आंत बैक्टीरिया मेजबान आंतों की कोशिकाओं के साथ बातचीत और मौलिक मेजबान प्रक्रियाओं को विनियमित, चयापचय गतिविधियों सहित, पोषक तत्व availabilities, प्रतिरक्षा प्रणाली मॉडुलन, और यहां तक कि मस्तिष्क समारोह और निर्णय लेने2,3 . एंडोबायोटिक्स में जीवाणु संरचना और आंत माइक्रोबायोटा की विविधता को प्रभावित करने की काफी क्षमता है। इस प्रकार एंडोबायोटिक्स और मानव आंत माइक्रोबायोटा के बीच बातचीत ने अनुसंधानपरध्यान 4 ,5,6,7,8,9की ओर आकर्षित किया है .
बायोएथिक्स और आर्थिक बाधाओं के कारण विवो में एंडोबायोटिक्स और मानव आंत माइक्रोबायोटा के बीच बातचीत का मूल्यांकन करना मुश्किल है। उदाहरण के लिए, एंडोबायोटिक्स और मानव आंत microbiota के बीच बातचीत की जांच प्रयोगों खाद्य एवं औषधि प्रशासन की अनुमति के बिना नहीं किया जा सकता है, और स्वयंसेवकों की भर्ती महंगा है. नतीजतन, पशु मॉडल अक्सर ऐसी जांच के लिए उपयोग किया जाता है. तथापि, पशु मॉडलों का उपयोग विभिन्न माइक्रोबायोटा रचनाओं और पशु बनाम मानव-संबद्ध समुदायों में विविधता के कारण सीमित है। एंडोबायोटिक्स और मानव आंत microbiota के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए इन विट्रो विधि में एक विकल्प बैच संस्कृति प्रयोगों के उपयोग के माध्यम से है।
Exopolysaccharides (ईपीएस) prebiotics कि मानव स्वास्थ्य के रखरखाव में महत्वपूर्ण योगदान कर रहे हैं10. विभिन्न मोनोसैकराइड रचनाओं और संरचनाओं से मिलकर बनता है कि अलग ईपीएस अलग कार्यों का प्रदर्शन कर सकते हैं। पिछले विश्लेषणों ने बिफ ईपीएस की संरचना निर्धारित की है, जो वर्तमान अध्ययन11में लक्षित प्रतिनिधि xenobiotic हैं। हालांकि, ईपीएस संरचना और विविधता के संबंध में मेजबान संबद्ध चयापचय प्रभाव पर विचार नहीं किया गया है।
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल Bif EPSs खमीर करने के लिए 12 स्वयंसेवकों से मल microbiota का उपयोग करता है. पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी), 16S RNA जीन उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण, और गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) तो ईपीएस और मानव आंत microbiota के बीच बातचीत की जांच करने के लिए संयोजन में उपयोग किया जाता है। विवो प्रयोगों की तुलना में इस प्रोटोकॉल के विशिष्ट लाभ इसकी कम लागत और मेजबान के चयापचय से हस्तक्षेप प्रभाव से परिहार कर रहे हैं. इसके अलावा, वर्णित प्रोटोकॉल अन्य अध्ययनों में इस्तेमाल किया जा सकता है कि endobiotics और मानव आंत microbiota के बीच बातचीत की जांच.
पिछले दशक में मानव आंत माइक्रोबायोटा संरचना और गतिविधियों को समझने की दिशा में महत्वपूर्ण प्रगति की गई है। इन अध्ययनों के परिणामस्वरूप, होलोबायोंट अवधारणा उभरा है, जो मेजबानों और संबद्ध माइक्रोबियल …
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन चीन के राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन (नहीं 31741109), Hunan प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नहीं 2018JJ3200), और विज्ञान और इंजीनियरिंग के Hunan विश्वविद्यालय में लागू विशेषता अनुशासन के निर्माण कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया. हम इस पांडुलिपि की तैयारी के दौरान अपनी भाषाई सहायता के लिए LetPub (www.letpub.com) धन्यवाद.
0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |