Analyse av interaksjoner mellom Endobiotics og Human gut bakterieflora bruke in vitro Bath Gjærings systemer
Summary
Beskrevet her er en protokoll for å undersøke samspillet mellom endobiotics og menneskelig gut bakterieflora bruker in vitro batch gjæring systemer.
Abstract
Menneskelige tarm mikroorganismer har nylig blitt et viktig mål for forskning for å fremme menneskers helse og forebygge sykdommer. Følgelig er undersøkelser av interaksjoner mellom endobiotics (f.eks. narkotika og Prebiotics) og tarm bakterieflora blitt et viktig forsknings emne. Men in vivo eksperimenter med frivillige mennesker er ikke ideelt for slike studier på grunn av bioetikk og økonomiske begrensninger. Som et resultat, har dyremodeller blitt brukt til å evaluere disse interaksjoner i vivo. Likevel, dyr modell studier er fortsatt begrenset av bioetikk betraktninger, i tillegg til ulike komposisjoner og forskjeller av bakterieflora i dyr kontra mennesker. En alternativ forskningsstrategi er bruken av batch gjæring eksperimenter som tillater evaluering av samspillet mellom endobiotics og gut bakterieflora in vitro. For å evaluere denne strategien ble bifidobacterial (Bif) exopolysaccharides (EPS) brukt som en representativ xenobiotic oval. Deretter ble samspillet mellom Bif EPS og menneskelige gut bakterieflora undersøkt ved hjelp av flere metoder som tynne-lags kromatografi (TLC), bakteriell samfunnet analyse med 16S rRNA genet høy gjennomstrømming sekvensering, og gass kromatografi av kort-kjeden fettsyrer (SCFAs). Presentert her er en protokoll for å undersøke samspillet mellom endobiotics og menneskelig gut bakterieflora bruker in vitro batch gjæring systemer. Viktigere, kan denne protokollen også endres for å undersøke generelle interaksjoner mellom andre endobiotics og gut bakterieflora.
Introduction
Gut bakterieflora spiller en viktig rolle i funksjon av menneskelig tarmen og i verts helse. Derfor har gut bakterieflora nylig blitt et viktig mål for sykdomsforebygging og terapi1. Videre, gut bakterier samhandle med vert intestinal celler og regulere grunnleggende verts prosesser, inkludert metabolske aktiviteter, næringsstoffer tilgjengelighet, immunsystem modulering, og til og med hjernefunksjon og beslutningstaking2,3 . Endobiotics har betydelig potensial til å påvirke bakteriell sammensetning og mangfoldet av gut bakterieflora. Dermed interaksjoner mellom endobiotics og menneskelig gut bakterieflora har tiltrukket økende forskning oppmerksomhet4,5,6,7,8,9.
Det er vanskelig å evaluere samspillet mellom endobiotics og menneskelig gut bakterieflora in vivo på grunn av bioetikk og økonomiske begrensninger. For eksempel, eksperimenter gransker samspillet mellom endobiotics og menneskelige gut bakterieflora kan ikke utføres uten tillatelse fra Food and Drug Administration, og rekruttering av frivillige er dyrt. Derfor er dyremodeller ofte brukt til slike undersøkelser. Imidlertid er bruken av dyremodeller begrenset på grunn av ulike bakterieflora komposisjoner og mangfold i dyr-vs. menneske-tilknyttede samfunn. En alternativ in vitro metode for å utforske samspillet mellom endobiotics og menneskelige gut bakterieflora er gjennom bruk av batch kultur eksperimenter.
Exopolysaccharides (EPSs) er Prebiotics som betydelig bidrar til opprettholdelse av menneskers helse10. Distinkte EPSs som består av ulike monosakkarid komposisjoner og strukturer kan vise distinkte funksjoner. Tidligere analyser har bestemt sammensetningen av Bif EPSs, som er representative xenobiotic oval som er målrettet i den aktuelle studien11. Men verts tilknyttede metabolske effekter har ikke blitt vurdert med hensyn til EPS sammensetning og mangfold.
Protokollen som er beskrevet her bruker avføring bakterieflora fra 12 frivillige til å gjære Bif EPSs. Tynne-lags kromatografi (TLC), 16S rRNA genet høy gjennomstrømming sekvensering, og gass kromatografi (GC) blir deretter brukt i kombinasjon for å undersøke samspillet mellom EPSs og menneskelige gut bakterieflora. Distinkte fordeler med denne protokollen i forhold til in vivo eksperimenter er dens lave kostnader og unngåelse av forstyrrende effekter fra vertens metabolisme. Videre kan den beskrevne protokollen brukes i andre studier som undersøker interaksjoner mellom endobiotics og menneskelige gut bakterieflora.
Protocol
Representative Results
Discussion
Betydelig fremgang har blitt gjort mot å forstå menneskelige gut bakterieflora sammensetning og aktiviteter i løpet av det siste tiåret. Som en konsekvens av disse studiene, har holobiont konseptet dukket opp, som representerer samspillet mellom verter og tilhørende mikrobielle samfunn, for eksempel i mellom mennesker og deres gut bakterieflora19,20. Videre mennesker er selv nå betraktet som superorganisms21, karakterisert ved at tar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble finansiert av National Nature Science Foundation i Kina (nr. 31741109), Hunan Natural Science Foundation (no. 2018JJ3200), og konstruere program av anvendt karakteristisk disiplin i Hunan University of Science and Engineering. Vi takker LetPub (www.letpub.com) for sin språklige assistanse under utarbeidelsen av dette manuskriptet.
Materials
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
- Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
- Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
- Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
- Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
- Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
- Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
- Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
- Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
- Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
- Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
- Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
- Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
- Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , (2018).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
- Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
- Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
- Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
- Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
- Malfertheiner, P., Nardone, G. Gut microbiota: the forgotten organ. Digestive Diseases. 29 (6), (2011).
- Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
- Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
- Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).
