Análisis de interacciones entre endobióticos y microbiota de tripa humana utilizando sistemas de fermentación de bañoin in vitro
Summary
Aquí se describe un protocolo para investigar las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentación por lotes in vitro.
Abstract
Los microorganismos intestinales humanos se han convertido recientemente en un objetivo importante de la investigación en la promoción de la salud humana y la prevención de enfermedades. En consecuencia, las investigaciones de interacciones entre endobióticos (por ejemplo, fármacos y prebióticos) y la microbiota intestinal se han convertido en un importante tema de investigación. Sin embargo, los experimentos in vivo con voluntarios humanos no son ideales para tales estudios debido a la bioética y las limitaciones económicas. Como resultado, se han utilizado modelos animales para evaluar estas interacciones in vivo. Sin embargo, los estudios de modelos animales siguen estando limitados por consideraciones de bioética, además de diferentes composiciones y diversidades de la microbiota en animales frente a humanos. Una estrategia de investigación alternativa es el uso de experimentos de fermentación por lotes que permiten evaluar las interacciones entre endobióticos y microbiota intestinal in vitro. Para evaluar esta estrategia, se utilizaron exopolisacáridos bifidobacterianos (Bif) como xenobiótico representativo. Luego, las interacciones entre Bif EPS y la microbiota intestinal humana se investigaron utilizando varios métodos como la cromatografía de capa delgada (TLC), el análisis de composición de la comunidad bacteriana con secuenciación de alto rendimiento del gen rRNA 16S y la cromatografía de gases de ácidos grasos de cadena corta (SCFA). Aquí se presenta un protocolo para investigar las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentación por lotes in vitro. Es importante destacar que este protocolo también se puede modificar para investigar las interacciones generales entre otros endobióticos y la microbiota intestinal.
Introduction
La microbiota intestinal desempeña un papel importante en el funcionamiento de los intestinos humanos y en la salud del huésped. En consecuencia, la microbiota intestinal se ha convertido recientemente en un objetivo importante para la prevención y la terapia de enfermedades1. Además, las bacterias intestinales interactúan con las células intestinales anfitrionas y regulan los procesos fundamentales del huésped, incluidas las actividades metabólicas, la disponibilidad de nutrientes, la modulación del sistema inmunitario e incluso la función cerebral y la toma de decisiones2,3 . Los endobióticos tienen un potencial considerable para influir en la composición bacteriana y la diversidad de la microbiota intestinal. Así, las interacciones entre endobióticos y microbiota intestinal humana han atraído una creciente atención de la investigación4,5,6,7,8,9.
Es difícil evaluar las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana in vivo debido a la bioética y las limitaciones económicas. Por ejemplo, los experimentos que investigan las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana no se pueden realizar sin el permiso de la Administración de Alimentos y Medicamentos, y el reclutamiento de voluntarios es costoso. En consecuencia, los modelos animales se utilizan a menudo para tales investigaciones. Sin embargo, el uso de modelos animales es limitado debido a las diferentes composiciones de microbiota y diversidad en las comunidades asociadas a los animales frente al ser humano. Un método in vitro alternativo para explorar las interacciones entre los endobióticos y la microbiota intestinal humana es a través del uso de experimentos de cultivo por lotes.
Los exopolisacáridos (SEP) son prebióticos que contribuyen significativamente al mantenimiento de la salud humana10. Los SAE distintos que consisten en diferentes composiciones y estructuras monosacáridos pueden exhibir funciones distintas. Los análisis anteriores han determinado la composición de los SAE Bif, que son el xenobiótico representativo al que se dirige en el actual estudio11. Sin embargo, efectos metabólicos asociados al huésped no se han considerado con respecto a la composición y diversidad EPS.
El protocolo descrito aquí utiliza la microbiota fecal de 12 voluntarios para fermentar Bif EPS. La cromatografía de capa delgada (TLC), la secuenciación de alto rendimiento del gen rRNA 16S y la cromatografía de gases (GC) se utilizan en combinación para investigar las interacciones entre los SSA y la microbiota intestinal humana. Las ventajas distintivas de este protocolo en comparación con los experimentos in vivo son su bajo costo y evitar los efectos de interferencia del metabolismo del huésped. Además, el protocolo descrito se puede utilizar en otros estudios que investigan interacciones entre endobióticos y microbiota intestinal humana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se han realizado progresos significativos hacia la comprensión de la composición y las actividades de la microbiota intestinal humana en la última década. Como consecuencia de estos estudios, ha surgido el concepto holobionte, que representa las interacciones entre los huéspedes y las comunidades microbianas asociadas, como entre los seres humanos y su microbiota intestinal19,20. Además, los seres humanos son incluso ahora considerados como superorganismos<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por la National Nature Science Foundation of China (No. 31741109), la Hunan Natural Science Foundation (No. 2018JJ3200), y el programa de construcción de disciplina característica aplicada en la Universidad de Ciencia e Ingeniería de Hunan. Agradecemos a LetPub (www.letpub.com) por su asistencia linguística durante la preparación de este manuscrito.
Materials
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
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