マクロファージに貪食アポトーシス胸腺細胞の実験的解析
Summary
ここでは、アポトーシス胸腺細胞および腹膜マクロファージを調製するためのプロトコールを提示し、efferocytosis の効率および特異的阻害剤媒介性貪食のアポトーシス胸腺細胞のブロッキングを分析する。このプロトコルは、人工ビーズおよび細菌を含む他の粒子の細胞媒介性クリアランスにおいて広範な適用を有する。
Abstract
細胞のアポトーシスは自然なプロセスであり、胚発育、恒常性調節、免疫寛容誘導、および炎症の解決において重要な役割を果たします。体内のアポトーシス破片の蓄積は、時間をかけて全身性自己免疫疾患につながる慢性炎症反応を引き起こす可能性があります。アポトーシス細胞の障害は、様々な自己免疫疾患に関与している。アポトーシスクリアランスは、生理的条件下で稀に検出される複雑なプロセスである。それは豊富な表面受容体とシグナル分子を含みます。アポトーシス細胞クリアランスの過程を研究することは、洞察力のある分子メカニズムとその後の生物学的反応をもたらし、新しい治療法の開発につながる可能性があります。ここでは、アポトーシス胸腺細胞の誘導に関するプロトコール、腹膜マクロファージの調製、およびフローサイトメトリーおよび顕微鏡法によるアポトーシス細胞クリアランスの解析について説明します。すべての細胞は特定の段階でアポトーシスを受け、多くの住宅および循環細胞はアポトーシスの破片を吸収することができます。したがって、ここで説明するプロトコルは、多くのアプリケーションで、アポトーシス細胞の結合および他の多くの細胞型による摂取を特徴付けるために使用することができる。
Introduction
私たちの体は、毎日1-10 のアポトーシス細胞を生成します。このような多数のアポトーシス細胞は、免疫応答が静止したままである方法でクリアされなければならない。アポトーシス細胞のクリアランスを適時に確保するために、多数の種類の組織の居住細胞および循環細胞がアポトーシス細胞1を巻き込むメカニズムを開発する。アポトーシスの機能不全調節は、様々な炎症性疾患および自己免疫2の発症および進行に関与している。アポトーシスはまた、癌の発症の病因および従来の治療法3,4に対するその後の耐性において重要な役割を果たす。アポトーシス細胞の除去は、一般に抗炎症反応を促進し、これは免疫学的許容寛容に結合し得る5。アポトーシス細胞クリアランスの障害は、自己免疫を促進し、ヒトおよびマウス6の両方における全身性自己免疫疾患の発症に寄与する。
細胞がアポトーシスを受けると、それらは内部リーフレットから膜の外側リーフレットにホスファチジルセリン (PtdSer) を暴露する。PtdSer は、その後、表面受容体を介して食細胞によって認識されるであろう。1ダース以上の受容体がアポトーシス細胞の貪食を認識および/または促進することが同定されている。一般に、アポトーシス細胞クリアランスには少なくとも3種類の表面受容体が関与する: テザリング受容体は、アポトーシス細胞を認識する。貪食のくすぐり, 開始します。chaperoning 受容体は、全体のプロセス7を促進する。TAM 受容体チロシンキナーゼ (TAM RTKs) は、 Tyro-3、 xl、およびMer から成り、主に免疫系8の骨髄細胞によって発現される。TAM RTKs の主な機能は、テザリング受容体としての役割を果たし、アポトーシス細胞や破片の貪食除去を促進することです。当社グループは、長年にわたり自己免疫の設定において、TAM 媒介性アポトーシス細胞クリアランスを研究してきました。ビタミン K 依存性タンパク質成長停止特異的タンパク質 6 (Gas6) およびプロテイン S (ProS) は、TAM 受容体9,10に結合し、活性化する。Gas6 は、心臓、腎臓、および肺で生成されます。長所は主に肝臓11で生産される。TAM は、Gas6/ProS の N 末端がアポトーシス細胞上の PtdSer に結合するような方法でアポトーシス細胞を認識し、Gas6/プロの C 末端は食細胞の表面に固定された TAM 受容体に結合します。他の受容体と共に、アポトーシス細胞の貪食が12に生じる。Mer はリガンドの長所と Gas6 の両方に結合することができますが、Gas6 は、抗 Mer 抗体13によってブロックすることができる、アポトーシス細胞の mer 媒介マクロファージ食のための唯一のリガンドであると思われることがわかりました。マクロファージはプロの食細胞です。マクロファージによるアポトーシス細胞の迅速なクリアランスは、細胞内抗原に対する炎症や自己免疫反応の阻害にとって重要である。Mer 受容体チロシンキナーゼは、マクロファージ貪食およびアポトーシス細胞14の効率的なクリアランスにとって重要である。マウス脾臓では、Mer は主にマージナルゾーンおよび有形の体マクロファージ13上に発現する。
ここで提示されるプロトコルは、細胞のアポトーシスを誘導し、プロセスと efferocytosis の効率を測定する方法を示すための基本的な方法を説明しています。これらのプロトコールは、異なる起源のアポトーシス細胞の貪食における他の細胞型による efferocytosis の研究に容易に適応することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
アポトーシスは、多くのシグナルカスケードを含み、タンパク質の発現、分泌、および輸送を誘導する高度に保存された細胞死プロセスです。アポトーシスは、しばしば細胞形態変化17に関連する。アポトーシス細胞は、食細胞を誘引するサイトカインおよびケモカインを積極的に放出し、貪食のプロセスを開始し、タイトコントロール18の下で非常に複雑…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
シャオ・ラボの研究は、医学部からの革新的な賞と、シンシナティ大学の内部医学部門からの若手教員パイロット賞と NIDDK/NIH からのグラント DK K01_095067 によって支えられています。
Materials
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
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