Brugen af mus mammary tumor celler i en in vitro invasion analyse som et mål for Oncogenic celle adfærd
Summary
In vitro celle invasion assay bruges til at måle potentialet i kræft metastaser ved at kvantificere det cellulære potentiale for invasion og migration ved hjælp af cellekultur indsætter indeholder protein matrix. Celler udfordres til at migrere gennem protein matrixen og en porøs membran, mod en kemoattraktant, og derefter kvantificeres ved let mikroskopi.
Abstract
In vitro invasion assay bruger en protein-rige matrix i en BoyDen kammer til at måle evnen af dyrkede celler til at passere gennem matrixen og en porøs membran i en proces, der svarer til de første skridt af cancer celle metastaser. De testede celler kan ændres for genekspression eller behandles med inhibitorer for at teste for ændringer i invasions potentialet. Dette eksperiment tester den aggressive fænotype af musen brysttumor celler til at opdage og karakterisere de potentielle onkogener, der fremmer celle invasion. Denne teknik kan dog være alsidig og tilpasset til mange forskellige applikationer. Eksperimentet i sig selv kan gøres på én dag, og resultaterne er erhvervet ved lys mikroskopi i mindre end en dag. Resultaterne omfatter optællinger af antallet af invaderende celler til sammenligning og analyse. In vitro invasion assay er en hurtig, billig, og klar-cut metode til bestemmelse af celle adfærd i en kultur, der kan bruges som en indledende vurdering før mere involveret i vivo assays.
Introduction
In vitro invasion assay kan være et nyttigt værktøj, når man måler en celles evne til at migrere gennem en protein-belagt membran, analogt med de første skridt i metastase. En vigtig funktion af maligne kræftceller er deres evne til at migrere gennem og invaderer nærliggende væv. Kræft, der har spredt eller stase udgør mere behandling udfordringer og har lavere satser for langvarig overlevelse, mens lokaliserede tumorer er lettere at behandle og har højere satser for langsigtet overlevelse. For at metastasize, kræftceller skal forlade den primære tumor og migrere ind i kredsløbssygdomme eller lymfesystem, en proces, der kræver passerer gennem ekstracellulære matrix og kælder membran1. I processen kaldet epitelial mesenchymal Transition (EMT), tumorcellerne skal bryde celle-celle kontakter, migrere direktionelt, og invaderer nærliggende blod eller lymfeknuder fartøjer. De første skridt i denne metastase kaskade er af stor interesse, da disse trin er, hvad der kan gøre kræft deadlier. De genetiske og epigenetiske faktorer, der er involveret i de tidlige faser af metastase er fokus for en stor mængde forskning, men nøjagtige og pålidelige eksperimentelle værktøjer er nødvendige for at teste disse tidlige trin både in vivo og in vitro.
Værktøjer til at måle ændringer i celle migration såsom sårheling (scratch) assays eller vækst i 3D-miljøer såsom bløde agar-analyser kan delvist løse behovet for eksperimentelle metoder til måling af tidlige trin af metastase, men en analyse til måling af invasion er mere udfordrende, da processen sker i kroppen inden for en kompleks tumor mikromiljø. Med henblik på screening af stoffer eller genændringer for at bestemme vigtige faktorer i invasion og metastase, et system, der kan bruges in vitro med dyrkede celler og efterligne de udfordringer, som metastatiske celler in vivo er invasion assay2, 3. Brystkræft er den mest almindeligt diagnosticeret type kræft i kvinder og den anden førende årsag til kræft død i kvinder, så forstå de gener, der er ansvarlige for brystkræft celle invasion og metastase er kritisk vigtigt for folkesundheden. Desuden er museceller et nyttigt model system til at studere brystkræft og dens progression.
In vitro-invasions analysen er baseret på BoyDen-kammer samlingen, hvor to kamre af vækstmedier adskilles af en porøs membran3. For at efterligne tumor mikromiljøet, en protein-rige gel er også inkluderet for at adskille celler i et kammer fra en chemoattraktant i den anden og fungere som en kælder membran barriere. For at migrere mod chemoattraktant skal cellerne først passere gennem den proteinrige barriere og derefter passere gennem den porøse membran-en proces svarende til, hvordan metastatiske celler migrerer gennem stroma. Den proteinholdige gel kan ændres baseret på eksperimentets behov, men består normalt af kollagen eller kælder membran ekstrakt (f. eks. Matrigel)4. Det er en kompleks blanding af proteiner, proteoglycaner og vækstfaktorer, men for det meste består af lamininer og kollagen IV 4,5. Cellerne skal derefter passere gennem en porøs membran, der typisk er fremstillet af polycarbonat, polyester eller polytetrafluorethylen (PTFE). Membraner kan købes kommercielt med eller uden en Proteingel (typisk collagens), eller gelen kan købes separat og tilsættes. Porestørrelsen kan justeres ud fra cellestørrelsen. Mens porestørrelser er tilgængelige fra 0,4-8,0 μm, er kun porer fra 3,0-8,0 μm store nok til celle migrering. Invasionen analyse er blevet brugt til at bestemme effektiviteten af inhibitorer på evnen af celler til at migrere og invade. Mens mangler den nøjagtige tumor mikromiljø, der er til stede in vivo, in vitro invasion assay er gavnlig på screening mange betingelser på kort tid samtidig minimere behovet for dyremodeller. Målet med disse eksperimenter er at sammenligne genekspression af formodede onkogener og bestemme virkningerne på cancer celle adfærd og sygdoms aggressivitet ved hjælp af in vitro invasion assay og andre tests. Samlet set, invasionen analyse giver konsistente, kvantitative, og hurtige resultater til bestemmelse af metastatisk potentiale samtidig også være en relativt billig, ligetil, og tilpasselig metode.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro invasion assay er en billig, hurtig, kvantitativ, og ligetil metode til at studere de faktorer, der fremmer kræft celle invasion. Brystkræft er den mest almindeligt diagnosticeret kræft blandt kvinder. Af de tre store undertyper af brystkræft, Triple negative, (eller ER-, PR-, HER2/Neu-), er den mest aggressive, mest sandsynligt at metastasize, og mest dødbringende9. Derfor, forstå de gener og udtryk, der resulterer i metastase kan hjælpe med at finde nye terapeutiske mål…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Grant R15CA169978 fra National Institutes of Health. Yderligere finansiering kom fra Villanova University.
Materials
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
- He, X., Lee, B., Jiang, Y. Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion. Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. 암 연구학. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. 암 연구학. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
