L'utilisation de cellules de tumeur mammaire de souris dans un analyse d'invasion in vitro comme mesure du comportement cellulaire oncogène
Summary
L’exemple d’invasion cellulaire in vitro est utilisé pour mesurer le potentiel de la métastes du cancer en quantifiant le potentiel cellulaire d’invasion et de migration à l’aide d’inserts de culture cellulaire contenant de la matrice protéique. Les cellules sont mises au défi de migrer à travers la matrice protéique et une membrane poreuse, vers un chimioattractant, puis quantifiées par microscopie légère.
Abstract
L’analyse d’invasion in vitro utilise une matrice riche en protéines dans une chambre Boyden pour mesurer la capacité des cellules cultivées à passer à travers la matrice et une membrane poreuse dans un processus analogue aux premières étapes de la métasse des cellules cancéreuses. Les cellules testées peuvent être modifiées pour l’expression du gène ou traitées avec des inhibiteurs pour tester les changements dans le potentiel d’invasion. Cette expérience teste le phénotype agressif des cellules de tumeur mammaire de souris pour découvrir et caractériser les oncogènes potentiels qui favorisent l’invasion cellulaire. Cette technique, cependant, peut être polyvalente et adaptée à de nombreuses applications différentes. L’expérience elle-même peut être faite en une journée et les résultats sont obtenus par microscopie légère en moins d’une journée. Les résultats comprennent le nombre de cellules envahissantes pour la comparaison et l’analyse. L’analyse d’invasion in vitro est une méthode rapide, peu coûteuse et claire pour déterminer le comportement cellulaire dans une culture qui peut être utilisée comme une évaluation initiale avant d’être plus impliquée in vivo.
Introduction
L’analyse d’invasion in vitro peut être un outil utile pour mesurer la capacité d’une cellule à migrer à travers une membrane enrobée de protéines, analogue aux premières étapes de la métastes. Une caractéristique clé des cellules cancéreuses malignes est leur capacité à migrer à travers et envahir les tissus voisins. Le cancer qui s’est propagé ou métastasé pose plus de défis de traitement et a des taux plus bas de survie à long terme, alors que les tumeurs localisées sont plus faciles à traiter et ont des taux plus élevés de survie à long terme. Afin de métastaser, les cellules cancéreuses doivent quitter la tumeur primaire et migrer dans le système circulatoire ou lymphatique, un processus qui nécessite de passer par la matrice extracellulaire et la membrane du sous-sol1. Dans le processus appelé la transition mésenchymale épithéliale (EMT), les cellules de tumeur doivent casser des contacts de cellule-cellule, migrer directionnellement, et envahir le sang ou les vaisseaux lymphatiques voisins. Les premières étapes de cette cascade de métastes sont d’un grand intérêt puisque ces étapes sont ce qui peut rendre le cancer plus mortel. Les facteurs génétiques et épigénétiques impliqués dans les premières étapes de la métastes font l’objet d’une grande quantité de recherche, mais des outils expérimentaux précis et fiables sont nécessaires pour tester ces premières étapes in vivo et in vitro.
Les outils pour mesurer les changements dans la migration cellulaire tels que la cicatrisation des plaies (rayures) ou la croissance dans les environnements 3D tels que les essais d’agar doux peuvent répondre en partie à la nécessité de méthodes expérimentales de mesure des premières étapes de la métasse, mais un test pour mesurer l’invasion est plus difficile puisque le processus se produit dans le corps dans un microenvironnement complexe de tumeur. Aux fins du dépistage des médicaments ou des altérations génétiques pour déterminer les facteurs importants dans l’invasion et la métastase, un système qui peut être utilisé in vitro avec des cellules cultivées et imiter les défis rencontrés par les cellules métastatiques in vivo est l’essai d’invasion2, 3. Le cancer du sein est le type de cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les femmes et la deuxième cause de décès par cancer chez les femmes, de sorte que la compréhension des gènes responsables de l’invasion des cellules du cancer du sein et des métastes est d’une importance cruciale pour la santé publique. En outre, les cellules de souris sont un système modèle utile pour étudier le cancer du sein et sa progression.
L’exemple d’invasion in vitro est basé sur l’assemblée de la Chambre Boyden où deux chambres de médias de croissance sont séparées par une membrane poreuse3. Pour imiter le microenvironnement de tumeur, un gel protéine-riche est également inclus pour séparer des cellules dans une chambre d’un chimioattractant dans l’autre et agir comme barrière de membrane de sous-sol. Afin de migrer vers le chimioattractant, les cellules doivent d’abord passer à travers la barrière riche en protéines, puis passer à travers la membrane poreuse – un processus analogue à la façon dont les cellules métastatiques migrent à travers le stroma. Le gel riche en protéines peut être modifié en fonction des besoins de l’expérience, mais se compose généralement de collagène, ou extrait de membrane de sous-sol (par exemple, Matrigel)4. Il s’agit d’un mélange complexe de protéines, de protéoglycanes et de facteurs de croissance, mais se compose principalement de laminins et de collagène IV 4,5. Les cellules doivent alors passer à travers une membrane poreuse typiquement faite de polycarbonate, de polyester ou de polytétrafluoroéthylène (PTFE). Les membranes peuvent être achetées commercialement avec ou sans gel protéique (généralement des collagènes), ou le gel peut être acheté séparément et ajouté. La taille des pores peut être ajustée en fonction de la taille de la cellule. Alors que les tailles de pores sont disponibles de 0,4 à 8,0 m, seuls les pores de 3,0 à 8,0 m sont assez grands pour la migration cellulaire. L’exemple d’invasion a été utilisé pour déterminer l’efficacité des inhibiteurs sur la capacité des cellules à migrer et à envahir. Bien qu’il manque le microenvironnement tumoral exact qui est présent in vivo, l’analyse d’invasion in vitro est bénéfique au dépistage de nombreuses conditions dans un court laps de temps tout en minimisant le besoin de modèles animaux. Le but de ces expériences est de comparer l’expression génique des oncogènes suspects et de déterminer les effets sur le comportement des cellules cancéreuses et l’agressivité de la maladie en utilisant l’analyse d’invasion in vitro et d’autres tests. Dans l’ensemble, l’essai d’invasion fournit des résultats cohérents, quantitatifs et rapides pour déterminer le potentiel métastatique tout en étant une méthode relativement peu coûteuse, simple et adaptable.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’essai d’invasion in vitro est une méthode peu coûteuse, rapide, quantitative, et simple pour étudier les facteurs favorisant l’invasion de cellules cancéreuses. Le cancer du sein est le cancer le plus souvent diagnostiqué chez les femmes. Des trois principaux sous-types de cancer du sein, triple négatif, (ou ER-, PR-, HER2/neu-), est le plus agressif, le plus susceptible de métastaser, et le plus mortel9. Par conséquent, la compréhension des gènes et de l’expression qui entra?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention R15CA169978 des National Institutes of Health. Des fonds supplémentaires ont été accordés à l’Université Villanova.
Materials
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
- He, X., Lee, B., Jiang, Y. Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion. Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. 암 연구학. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. 암 연구학. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
