השימוש של העכבר בתאי סרטן הגידול בתוך שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמדד של התנהגות התא אונגניים
Summary
בשנת מבחנה הפלישה תא מתורבת משמש כדי למדוד את הפוטנציאל של גרורות סרטן על ידי כימות הפוטנציאל התאי עבור פלישה והגירה באמצעות התרבות תאים מוסיף חלבון מטריצה. התאים מאותגרים לעבור דרך מטריצת החלבונים וממברנה נקבובי, לכיוון מיקרוסטנט, ולאחר מכן כימות על ידי מיקרוסקופ אור.
Abstract
שיטת הפלישה מחוץ למבחנה משתמשת במטריצה עשירה בחלבון בחדר Boyden כדי למדוד את היכולת של תאים מתורבתים לעבור דרך מטריקס וקרום נקבובי בתהליך הדומה לשלבים הראשוניים של גרורות בתאי סרטן. התאים נבדק ניתן לשנות עבור ביטוי הגנים או מטופלים עם מעכבי כדי לבדוק שינויים בפוטנציאל הפלישה. ניסוי זה בוחן את הפנוטיפ האגרסיבי של תאים סרטניים בפטמות העכבר כדי לגלות ולאפיין את אונגנים פוטנציאליים המעודדים הפלישה התא. טכניקה זו, לעומת זאת, יכולה להיות מגוונת ומותאמת ליישומים רבים ושונים. הניסוי עצמו יכול להיעשות ביום אחד והתוצאות נרכשים על ידי מיקרוסקופ קל בפחות מיום. התוצאות כוללות ספירות של מספר תאים פולשים להשוואה וניתוח. הבדיקה של הפלישה מחוץ לעולם היא שיטה מהירה, זולה, וברורה לחתוך לקביעת התנהגות התא בתרבות שניתן להשתמש בה כהערכה ראשונית לפני מעורב יותר vivo assays.
Introduction
שיטת הפלישה מחוץ למבחנה יכולה להיות כלי שימושי כאשר מדידת היכולת של התא לעבור דרך ממברנה מצופה חלבון, מקבילה לצעדים הראשונים גרורות. תכונה מפתח של תאים סרטניים ממאירים היא היכולת שלהם להגר דרך לפלוש רקמות סמוכות. סרטן שהתפשט או גרורות מהווה אתגרים טיפול יותר ויש לו שיעורי נמוך יותר של הישרדות ארוכת טווח, בעוד גידולים מקומיים קל יותר לטפל ויש להם שיעור גבוה יותר של הישרדות לטווח ארוך. על מנת גרורות, תאים סרטניים חייבים לעזוב את הגידול העיקרי להגר לתוך הדם או מערכת הלימפה, תהליך אשר דורש לעבור דרך מטריצה החילוץ וממברנה מרתף1. בתהליך שנקרא מעבר האפיתל mesenchymal (פרמדיק), את התאים הסרטניים חייבים לשבור את הקשר תא התא, להעביר מבחינה מבצעית, ולפלוש דם הסמוך או כלי הלימפה. הצעדים הראשוניים של המפל גרורות זה הם בעלי עניין רב מאז שלבים אלה הם מה שיכול להפוך סרטן קטלני. הגורמים הגנטיים והאפיגנטיים המעורבים בשלבים המוקדמים של גרורות הם המוקד של כמות גדולה של מחקר, אך כלים ניסיוניים מדויקים ואמינים נחוצים כדי לבדוק את הצעדים המוקדמים הללו הן בvivo והן בתחום החוץ.
כלים למדוד שינויים בהעברת תאים כגון ריפוי בפצע (שריטה) בחני או צמיחה בסביבות תלת-ממד כגון מראה רך אגר יכול באופן חלקי לענות על הצורך בשיטות ניסיוני של מדידת צעדים מוקדמים של גרורות, אבל הטיפול כדי למדוד הפלישה הוא מאתגרת יותר מאז התהליך מתרחשת בגוף בתוך מיקרוסביבה מורכבת הגידול. לצורך הקרנת תרופות או שינויים גנים כדי לקבוע גורמים חשובים בפלישה גרורות, מערכת שניתן להשתמש בתוך מבחנה עם תאים מתורבתים ולחקות את האתגרים הניצבים על ידי תאים גרורתי ב vivo היא האפשרות הפלישה2, 3. שלוש. סרטן השד הוא סוג הנפוץ ביותר של סרטן בנשים והגורם המוביל השני של מוות סרטן אצל נשים, כך הבנה הגנים האחראים לפלישה לסרטן השד וגרורות הוא חשוב באופן ביקורתי לבריאות הציבור. יתר על כן, תאי העכבר הם מערכת מודל שימושי ללמוד סרטן השד ההתקדמות שלה.
שיטת הפלישה החוץ גופית מבוססת על האסיפה קאמרית Boyden שבו שני התאים של התקשורת הצמיחה מופרדים על ידי קרום נקבובי3. כדי לחקות את מיקרוסביבה הגידול, ג’ל עשיר בחלבון נכלל גם בתאים נפרדים בחדר אחד מתוך כימוסטנט בשני ולשמש מחסום קרום המרתף. על מנת לעבור לכיוון הדרך, התאים חייבים תחילה לעבור דרך המכשול עשיר בחלבון ולאחר מכן לעבור דרך קרום נקבובי-תהליך הדומה כיצד תאים גרורתי להגר דרך משתית. ג’ל עשיר חלבון ניתן לשנות בהתבסס על הצרכים של הניסוי, אבל בדרך כלל מורכב קולגן, או תמצית קרום המרתף (למשל, מטריצות)4. זהו תערובת מורכבת של חלבונים, פרוטאוגליקנים וגורמי גדילה, אבל בעיקר מורכב של למינציה ו קולגן הרביעי 4,5. תאים לאחר מכן לעבור דרך קרום נקבובי בדרך כלל עשוי פוליקרבונט, פוליאסטר, או polyטטרפלואורואתילן (מצופה). ניתן לרכוש ממברנות מסחרית עם או בלי ג’ל חלבון (בדרך כלל collagens), או ג’ל ניתן לרכוש בנפרד והוסיף. גודל הנקבוביות ניתן לכוונן על בסיס גודל התא. בעוד גדלי נקבוביות זמינים מ 0.4-8.0 יקרומטר, רק נקבוביות מ 3.0-8.0 יקרומטר הם גדולים מספיק עבור הגירה תא. שיטת הפלישה שימש כדי לקבוע את האפקטיביות של מעכבי על היכולת של תאים להגר ולפלוש. בעוד המחסור המדויק הגידול מיקרוסביבה כי הוא קיים בvivo, שיטת הפלישה מחוץ למבחנה היא מועילה בסינון תנאים רבים תוך זמן קצר תוך מזעור הצורך מודלים בעלי חיים. המטרה של ניסויים אלה היא להשוות את הביטוי הגנטי של החשוד אונגנים ולקבוע את ההשפעות על התנהגות תא סרטן תוקפנות מחלה באמצעות שיטת הפלישה מחוץ למבחנה ובדיקות אחרות. באופן כללי, שיטת הפלישה מספקת תוצאות עקביות, כמותיים ומהירות לקביעת פוטנציאל גרורתי תוך היותו גם שיטה זולה, פשוטה וישימה באופן יחסי.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת הפלישה לחוץ-גופית היא שיטה זולה, מהירה, כמותית וישירה לחקר הגורמים המקדמים את הפלישה לתא הסרטן. סרטן השד הוא הסרטן השכיח ביותר בקרב נשים. של שלושת סוגי המשנה העיקריים של סרטן השד, משולש שלילי, (או ER-,PR-, HER2/או-), הוא אגרסיבי ביותר, קרוב לוודאי גרורות, ואת הקטלנית ביותר9. לכ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי גרנט R15CA169978 מן המכונים הלאומיים לבריאות. מימון נוסף הגיע מאוניברסיטת וילאנובה.
Materials
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
- He, X., Lee, B., Jiang, Y. Cell-ECM Interactions in Tumor Invasion. Advances in Experimental Medicine and Biology. 936, 73-91 (2016).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. 암 연구학. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Simon, N., Noel, A., Foidart, J. M. Evaluation of in vitro reconstituted basement membrane assay to assess the invasiveness of tumor cells. Invasion and Metastasis. 12 (3-4), 156-167 (1992).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 3-18 (2014).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Kang, J. J., Schwegel, T., Knepper, J. E. Sequence similarity between the long terminal repeat coding regions of mammary-tumorigenic BALB/cV and renal-tumorigenic C3H-K strains of mouse mammary tumor virus. Virology. 196 (1), 303-308 (1993).
- Slagle, B. L., Lanford, R. E., Medina, D., Butel, J. S. Expression of mammary tumor virus proteins in preneoplastic outgrowth lines and mammary tumors of BALB/cV mice. 암 연구학. 44 (5), 2155-2162 (1984).
- Schmidt, J. A., et al. Regulation of the oncogenic phenotype by the nuclear body protein ZC3H8. BMC Cancer. 18 (1), 759 (2018).
- Neophytou, C., Boutsikos, P., Papageorgis, P. Molecular Mechanisms and Emerging Therapeutic Targets of Triple-Negative Breast Cancer Metastasis. Frontiers in Oncology. 8, 31 (2018).
- Al-Alwan, M., et al. Fascin is a key regulator of breast cancer invasion that acts via the modification of metastasis-associated molecules. PloS One. 6 (11), e27339 (2011).
- Wang, M. J., Zhang, H., Li, J., Zhao, H. D. microRNA-98 inhibits the proliferation, invasion, migration and promotes apoptosis of breast cancer cells by binding to HMGA2. Bioscience Reports. 38 (5), (2018).
- Zheng, Y. F., Luo, J., Gan, G. L., Li, W. Overexpression of microRNA-98 inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis via claudin-1 in human colorectal carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 6090-6105 (2019).
- Yan, W., Cao, Q. J., Arenas, R. B., Bentley, B., Shao, R. GATA3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 14042-14051 (2010).
