DNA-sequentie herkenning door DNA primase met behulp van high-throughput Primase profilering
Summary
Experimenten met eiwitbinding Microarray (PBM) in combinatie met biochemische assays koppelen de bindende en katalytische eigenschappen van DNA primase, een enzym dat RNA-primers op Template DNA synthetiseert. Deze methode, aangeduid als high-throughput Primase profilering (HTPP), kan worden gebruikt om DNA-bindende patronen van een verscheidenheid aan enzymen te onthullen.
Abstract
DNA primase synthetiseert korte RNA-primers die DNA-synthese van Okazaki fragmenten op de achterblijvende streng door DNA-polymerase tijdens DNA-replicatie initiëren. De binding van prokaryotische DnaG-achtige primases aan DNA vindt plaats in een specifieke trinucleotide-herkennings sequentie. Het is een cruciale stap in de vorming van Okazaki fragmenten. Conventionele biochemische hulpmiddelen die worden gebruikt om de DNA-herkennings volgorde van DNA primase te bepalen, bieden slechts beperkte informatie. Met behulp van een op hoge doorvoer microarray gebaseerde bindende assay en opeenvolgende biochemische analyses, is aangetoond dat 1) de specifieke bindende context (flankerende sequenties van de herkennings plaats) de bindende sterkte van het DNA primase op zijn template beïnvloedt DNA, en 2) sterkere binding van Primase aan het DNA levert langere RNA-primers op, wat duidt op een hogere processiviteit van het enzym. Deze methode combineert PBM en Primase activity assay en is aangewezen als high-throughput Primase profilering (HTPP), en het maakt karakteriseren van specifieke sequentie herkenning door DNA primase in ongekende tijd en schaalbaarheid mogelijk.
Introduction
HTPP maakt gebruik van DNA-bindende microarray-technologie in combinatie met biochemische analyse (Figuur 1) om statistisch specifieke kenmerken van DNA-templates te identificeren die de enzymatische activiteit van DNA primase beïnvloeden. Daarom biedt HTPP een technologisch platform dat een kennis sprong in het veld vergemakkelijkt. De klassieke instrumenten die worden gebruikt om de Primase herkennings locaties te bepalen, hebben niet de mogelijkheid om enorme hoeveelheden gegevens te leveren, terwijl HTPP dat wel doet.
PBM is een techniek die routinematig wordt gebruikt om de bindende voorkeuren van transcriptiefactoren te bepalen naar DNA1,2; het is echter niet geschikt voor het opsporen van zwakke/voorbijgaande binding van eiwitten aan DNA. In tegenstelling tot de universele PBM die informatie verschaft over de gemiddelde eiwit bindende specificiteit van alle mogelijke sequenties bestaande uit acht basis paren, is HTPP gebaseerd op de bibliotheek van enkel-streng DNA-templates, bestaande uit unieke sequentie-elementen. Dergelijke DNA sequentie elementen omvatten tienduizenden korte (enkele tientallen BP) genomische sequenties, evenals computationeel ontworpen DNA sequenties verrijkt in bepaalde DNA repetitieve sequentie elementen aanwezig in het genoom, die beschikken over verschillende gemiddelde GC inhoud . Een dergelijke aanpak met hoge doorvoer maakt het mogelijk om, op een systematische, kwantitatieve en hypothese-gestuurde manier, de sequentie-gerelateerde eigenschappen te bepalen die belangrijk zijn voor de binding van Primase en de enzymatische activiteit3. In het bijzonder is het belangrijke verband tussen de voorkeuren van Primase-DNA-binding (gemoduleerd door DNA-sequenties flankerende specifieke Tri-nucleotide binding sites) en Primase processiviteit geïdentificeerd voor dit enzymatische systeem4.
De nieuwe technologie werd toegepast om onze kennis van de herkenningspunten van Primase te herbekijken, zelfs voor de T7 DNA primase die uitgebreid is bestudeerd5. In het bijzonder heeft het opnieuw onderzoeken van klassieke concepten, zoals DNA-herkennings locaties van T7 DNA primase (die bijna vier decennia geleden werden vastgesteld 6) met behulp van PROTEÏNE-DNA binding Microarray (PBM) geleid tot ongekend inzicht in functies die verband houden met de flankerende volgorde van deze herkennings locaties3. Verwacht werd dat de sequenties flankerende Tri-nucleotide herkenning plaats van T7 DNA primase (5 ‘-GTC-3 ‘) willekeurig zal zijn. In plaats daarvan ontdekten we dat TG-rijke flankerende sequenties de kans van T7 DNA primase vergroten om langere RNA-primers te synthetiseren die wijzen op een toename van processiviteit.
Andere methoden die kunnen worden gebruikt om DNA-bindende eigenschappen van eiwitten in vitro te bestuderen, zijn onder andere de elektroforetisch Mobility Shift assay (EMSA)7, DNase I Footprinting8, Surface-Plasmon Resonance (SPR)9en zuidwestelijke blotting 10. Dit zijn echter methoden met een lage doorvoer die alleen van toepassing zijn op het onderzoeken van een klein aantal DNA-sequenties. Bovendien is de nauwkeurigheid en gevoeligheid van sommige van deze technieken (bijv. EMSA) laag. Aan de andere kant is in vitro selectie11 een techniek die, net als PBM, kan worden gebruikt voor de identificatie van talrijke bindings sequenties. Echter, lage affiniteit reeksen worden meestal uitgesloten in de meeste toepassingen van in vitro selectie; Daarom is deze benadering niet geschikt voor het verkrijgen van vergelijkende bindingsgegevens voor alle beschikbare reeksen. De universele PBM1,2wordt voornamelijk gebruikt om de bindende kenmerken van transcriptiefactoren van prokaryoten en eukaryoten te karakteriseren, evenals specifieke factoren (bijv. de aanwezigheid van bepaalde liganden, cofactoren, enz.) die kunnen invloed op deze interactie12.
HTPP breidt de PBM-toepassing uit naar DNA-verwerkings enzymen door ongekende hoge doorvoer statistisch vermogen te combineren met hoge precisie om informatie te bieden over de bindings sequentie context. Dergelijke gegevens zijn nog niet verkregen voor primases en verwante enzymen (die een zwakke/voorbijgaande binding hebben met DNA) als gevolg van bovengenoemde technische beperkingen van andere beschikbare technieken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De PBM-methode is op grote schaal gebruikt om bindende eigenschappen van transcriptiefactoren te onderzoeken en kan ook worden toegepast op DNA-verwerkings enzymen, zoals DNA primase, die binden aan DNA met een lage affiniteit. Er zijn echter bepaalde wijzigingen van experimentele procedures vereist. Het microarray-experiment omvat verschillende stappen: ontwerp van de DNA-bibliotheek, voorbereiding van de chip, binding van het eiwit doelwit, fluorescerende labeling en scannen. Milde wasstappen zijn van cruciaal belang, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1023/18).
Materials
| 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution | Merck | 1006401000 | |
| 95% formamide | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-conjugated anti-his antibody | Qiagen | 35310 | |
| Ammonuium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| Boric acid, granular | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin jar | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA microarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 phosphorimager | FUJIFILM Life Science | ||
| Glass slide staining rack | Thermo Scientific | 12869995 | If several slides are used |
| Lab rotator | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Microarray Hybridization Chamber | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Microarray scanner (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Potassium glutamate | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Salmon testes DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Skim milk powder | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Staining dish | Thermo Scientific | 12657696 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Xylene cyanol | Alfa Aesar | B21530 |
References
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
- Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
- Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).
- Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).
- Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).
- Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).
- Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).
