에틸 메탄술포네이트 돌연변이 발생에 의한 작은 곡물 작물의 게놈(TILLING) 인구에 있는 표적으로 한 현지 병변의 발달
Summary
기재된 것은 돌연변이원으로서 에틸 메탄설포네이트(EMS)를 사용하는 작은 곡물 작물에서 게놈(TILLING) 집단의 표적화 유도국소 병변을 개발하기 위한 프로토콜이다. 또한 Cel-1 분석규를 이용한 돌연변이 검출프로토콜이 제공된다.
Abstract
게놈에서 유도된 국소 병변을 표적으로 하는 것은 (TILLING) 표적 유전자에 있는 화학적인 돌연변이 및 서열 변이의 탐지를 포함하는 강력한 역유전학 공구입니다. TILLING은 유전자 검증을 위한 매우 가치 있는 기능성 유전체학 도구로, 특히 변형 기반 접근법이 심각한 한계를 가지고 있는 작은 곡물에서 특히 중요합니다. 강력한 돌연변이 집단을 개발하는 것은 TILLING 기반 유전자 검증 연구의 효율성을 결정하는 열쇠입니다. 낮은 전반적인 돌연변이 빈도를 가진 TILLING 인구는 비실질적으로 큰 인구가 부족한 부족으로 이끌어 내는 인구에 있는 높은 사망으로 이끌어 내는 반면, 원하는 돌연변이를 찾아내는 것을 가려야 한다는 것을 표시합니다 돌연변이 된 개인의 수. 효과적인 인구가 개발되면 관심 있는 유전자에서 돌연변이를 감지하는 여러 가지 방법이 있으며 플랫폼의 선택은 실험 적 규모와 자원의 가용성에 달려 있습니다. 돌연변이 식별을 위한 Cel-1 분석 및 아가로즈 겔 기반 접근법은 편리하고 재현 가능하며 자원 집약적인 플랫폼입니다. 그것은 간단하다는 점에서 유리하다, 어떤 계산 지식을 필요로하지 않으며, 기본 실험실 장비를 가진 유전자의 소수의 유효성 검사에 특히 적합하다. 본 기사에서, 설명된 양호한 틸링 집단의 개발 방법은, 투여 곡선의 제조, 돌연변이 집단의 돌연변이 발생 및 유지, 및 PCR 기반 Cel-1 분석법을 이용한 돌연변이 집단의 스크리닝을 포함하는 것이다. .
Introduction
게놈에 있는 점 돌연변이는 연구원을 위한 많은 유용한 목적을 봉사할 수 있습니다. 그들의 성격 과 위치에 따라, 이 돌연변이는 관심 있는 단백질의 유전자 또는 명백한 도메인에 기능을 할당하기 위하여 이용될 수 있습니다. 한편, 새로운 유전적 변이의 근원으로서, 유용한 돌연변이는 자형질 나는 스크린을 사용하여 원하는 특성에 대해 선택될 수 있고 작물 개선에 더 많이 사용될 수 있다. TILLING은 표적 유전자에서 화학적 돌연변이 발생 및 서열 변이의 검출을 포함하는 강력한 역유전학 도구이다. 애기장대 1과 초록색 멜라노가스터2에서 처음 개발된 틸링 개체수는 헥사플로이드 빵 밀(Triticumaestivum)3, 보리(Hordeum vulgare)4,테트라포이드 듀럼 밀 (T.dicoccoides durum)5, 디플로이드 밀 (T.모노 코쿰)6 및 밀 Aegilops tauschii7의 “D”게놈 선조 . 이러한 자원은 비생물성 및 생물학적 스트레스 내성 조절 8, 개화 시간조절 9,영양적으로 우수한 작물 품종 을 개발하는 유전자의 역할을 검증하는 데 사용되었습니다5.
틸링, 에틸 메탄설포네이트 (EMS), 나트륨 아지드, N-메틸 -N-n-n-nitrosourea (MNU) 및 메틸 메탄 술포네이트 (MMS)와 같은 알킬라이팅 돌연변이 성 제제의 사용과 함께, 여러 가지 이유로 다른 역 유전학 도구에 비해 장점이 있습니다. 먼저, 돌연변이 발생은 거의 모든 종 또는 다양한 식물(10)에서 수행될 수 있으며, 변형 병목 현상과 무관하며, 이는 작은입자(11)의경우에 특히 도전적이다. 둘째, 다른 유전자 유효성 검사 접근법에 의해 수득될 수 있는 녹아웃 돌연변이를 생성하는 것 외에도, 관심 있는 단백질의 개별 도메인의 기능을 분별할수 있는 다양한 오센스 및 접합 돌연변이가 유도될 수 있다. 더욱이, 틸링은 게놈을 통하여 돌연변이의 불멸의 집합을 생성합니다; 따라서, 단일 집단은 다중 유전자의 기능적 검증을 위해 사용될 수 있다. 대조적으로, 그밖 역유전학 공구는 연구13의밑에 유전자에특정 자원을 생성합니다. TILLING을 통해 확인된 유용한 돌연변이는 번식 목적으로 전개될 수 있으며, 유전자 편집과 달리 많은 국가에서 비유전자 변형 분류가 아직 불확실하다는 규제의 대상이 되지 않습니다. 이것은 국제적으로 거래되는 작은 곡물과 특히 관련이있습니다14.
TILLING은 간단하고 효율적인 유전자 검증 전략이며 관심 있는 유전자를 조사하기 위해 돌연변이 집단을 개발해야 합니다. 효과적인 돌연변이 집단을 개발하는 것은 TILLING 기지를 둔 유전자 검증 연구 결과의 효율성을 결정하는 열쇠입니다. 낮은 전반적인 돌연변이 빈도를 가진 TILLING 인구는 비현실적으로 큰 인구가 원하는 돌연변이를 위해 가려져야 한다는 것을, 반면 높은 돌연변이 원 농도는 인구에 있는 높은 사망으로 이끌어 내고 부족한 수의 돌연변이 개인. 좋은 인구가 개발되면 관심있는 유전자에서 돌연변이를 감지하는 여러 가지 방법이 있으며 플랫폼의 선택은 실험 적 규모와 자원의 가용성에 달려 있습니다. 전체 게놈 시퀀싱 및 엑솜 시퀀싱은 작은 게놈15,16을가진 식물에서 틸링 집단의 모든 돌연변이를 특성화하는 데 사용되어 왔다. 2개의 틸링 집단의 엑소메 시퀀싱은 빵과 듀럼 밀에서 수행되었으며 바람직한 돌연변이를 식별하고 관심 있는 돌연변이 라인을 주문하기 위한 대중에게 제공된다17. 그것은 바람직한 돌연변이의 가용성 측면에서 훌륭한 공공 자원입니다. 그러나, 유전자 검증 연구에서, 야생형 선은 관심 있는 후보 유전자를 소유해야 한다. 불행하게도, 다른 배경에서 몇 가지 후보 유전자의 역유전학 기반 유효성 검사를 위해 전체 틸링 집단의 엑소메를 서열화하는 것은 여전히 비용이 많이 든다. Amplicon 시퀀싱 및 Cel-1 기반 분석은 밀의 표적 집단에서 돌연변이를 검출하는 데 사용되어 왔으며, Cel-1 분석제는 더 간단하고 계산 지식이 필요하지 않으며, 기본유전자의 소수의 유효성 검사에 특히 적합합니다. 실험실장비 6,18.
본 기사에서, 설명된 양호한 틸링 집단의 개발을 위한 방법은, 투여 곡선의 제조, 돌연변이 집단의 돌연변이 생성 및 유지, 및 PCR 기반 Cel-1 분석법을 이용한 돌연변이 집단의 스크리닝을 포함하는 것이다. . 이 프로토콜은 이미 트리티쿰 aestivum, Triticum monoccocum6, 보리, Aegilops tauchii7,및 몇몇의 돌연변이 인구를 개발하고 활용하는 데 성공적으로 구현되었습니다. 다른. 여기에는 연구원이 틸링 인구를 개발하는 데 도움이되는 유용한 팁과 함께 이러한 방법의 명시적 세부 사항이 포함되어 있으며, EMS를 선택한 작은 곡물 식물에서 돌연변이 원으로 사용하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING은 유전자 검증을 위한 매우 가치 있는 역유전학 도구이며, 특히 변형 기반 접근법이 심각한 병목 현상이 있는 작은 곡물의 경우11. 높은 돌연변이 빈도로 돌연변이 집단을 개발하는 것은 기능적 유전체학 연구를 수행하는 데 중요한 단계 중 하나입니다. 강력한 TILLING 인구를 개발하는 데 가장 중요한 단계는 EMS의 최적의 농도를 결정하는 것입니다. M1에서 40%-60%의 생…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 농무부 국립 식품 농업 연구소에 의해 지원되었다, 해치 프로젝트 1016879 및 MAES 그랜트 No. 2956952를 통해 메릴랜드 농업 실험 역.
Materials
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
References
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