एथिल मिथेनसल्फोनेट म्यूटजेनेसिस द्वारा छोटे अनाज फसलों में जीनोम्स (TILLING) जनसंख्या में स्थानीय लेसेंस को लक्षित करने का विकास
Summary
एथिल मेथेनसल्फोनेट (ईएमएस) को म्यूटेजन के रूप में उपयोग के साथ छोटी अनाज फसलों में लक्षित प्रेरित स्थानीय लेसेंस (TILLING) जनसंख्या विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। इसके अलावा प्रदान की Cel-1 परख का उपयोग उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल है.
Abstract
जीनोम्स में प्रेरित स्थानीय लेसेंस को लक्षित करना (TILLING) एक शक्तिशाली रिवर्स जेनेटिक्स उपकरण है जिसमें रासायनिक उत्परिवर्तन और लक्ष्य जीनों में अनुक्रम भिन्नता का पता लगाना शामिल है। TILLING जीन सत्यापन के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान कार्यात्मक जीनोमिक्स उपकरण है, विशेष रूप से छोटे अनाज में जिसमें परिवर्तन आधारित दृष्टिकोण गंभीर सीमाओं पकड़. एक मजबूत mutagenized आबादी का विकास एक TILLING आधारित जीन सत्यापन अध्ययन की दक्षता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक कम समग्र उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ एक TILLING आबादी इंगित करता है कि एक अव्यावहारिक बड़ी आबादी वांछित उत्परिवर्तनों को खोजने के लिए जांच की जानी चाहिए, जबकि एक उच्च mutagen एकाग्रता जनसंख्या में उच्च मृत्यु दर की ओर जाता है, एक अपर्याप्त करने के लिए अग्रणी mutagenized व्यक्तियों की संख्या. एक बार एक प्रभावी जनसंख्या विकसित की है, वहाँ ब्याज की एक जीन में उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए कई तरीके हैं, और मंच का चुनाव प्रयोगात्मक पैमाने और संसाधनों की उपलब्धता पर निर्भर करता है. उत्परिवर्ती पहचान के लिए Cel-1 परख और agarose जेल आधारित दृष्टिकोण सुविधाजनक है, reproduible, और एक कम संसाधन गहन मंच. यह फायदेमंद है कि यह सरल है, कोई गणना ज्ञान की आवश्यकता होती है, और यह बुनियादी प्रयोगशाला उपकरणों के साथ जीन की एक छोटी संख्या के सत्यापन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है. वर्तमान लेख में, वर्णित एक अच्छा TILLING आबादी के विकास के लिए तरीके हैं, खुराक वक्र की तैयारी सहित, mutagenesis और उत्परिवर्ती आबादी के रखरखाव, और पीसीआर आधारित Cel-1 परख का उपयोग उत्परिवर्ती आबादी की स्क्रीनिंग .
Introduction
जीनोम में प्वाइंट उत्परिवर्तन शोधकर्ताओं के लिए कई उपयोगी उद्देश्यों की सेवा कर सकते हैं। उनकी प्रकृति और स्थान के आधार पर, इन उत्परिवर्तनों जीन या ब्याज की प्रोटीन के भी अलग डोमेन के लिए कार्य आवंटित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दूसरी ओर, उपन्यास आनुवंशिक भिन्नता के एक स्रोत के रूप में, उपयोगी उत्परिवर्तनों phenotyping स्क्रीन का उपयोग कर वांछित लक्षण के लिए चुना जा सकता है और आगे फसल सुधार में इस्तेमाल किया. TILLING एक शक्तिशाली रिवर्स आनुवंशिकी उपकरण है कि रासायनिक mutagenesis और लक्ष्य जीन में अनुक्रम भिन्नता का पता लगाने भी शामिल है. सबसे पहले अरिबिडोप्सिस1 और ड्रोसोफिलिया मेलेनोगैस्टर2में विकसित किया गया है , टिलिंग आबादी को विकसित किया गया है और कई छोटे अनाज फसलों जैसे हेक्सागुणित रोटी गेहूं (ट्राइटिकम एस्टिवम)3, जौ (होर्डमवल्गे )4, टेट्रापलॉयड ड्यूरम गेहूं (टी. डाइकोकोइड्स ड्यूरम)5, द्विगुणित गेहूं (टी मोनोकोकम)6 और “डी” जीनोम जनक गेहूं एगिलोप्स टौशीई7 . इन संसाधनों का उपयोग अजैविक और जैविक प्रतिबल सहिष्णुता8को विनियमित करने , फूलों केसमय9को विनियमित करने और पोषण से बेहतर फसल किस्मों के विकास में जीनों की भूमिका को सत्यापित करने के लिए किया गया है .
TILLING, इस तरह के एथिल मीथेनसल्फोनेट (ईएमएस), सोडियम azide, एन-मेथिल-एन-नाइटोसौरिया (एमएनयू), और मिथाइल मीथेनसल्फोनेट (एमएमएस) के रूप में alkylating mutagenic एजेंटों के उपयोग के साथ, कई कारणों के लिए अन्य रिवर्स आनुवंशिकी उपकरण ों पर लाभ है। सबसे पहले, mutagenesis व्यावहारिक रूप से किसी भी प्रजाति या पौधे की विविधता पर आयोजित किया जा सकताहै 10 और परिवर्तन बाधा है, जो छोटे अनाज11के मामले में विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है से स्वतंत्र है. दूसरा, नॉकआउट उत्परिवर्तनों कि अन्य जीन सत्यापन दृष्टिकोण द्वारा प्राप्त किया जा सकता पैदा करने के अलावा, missense और splicing उत्परिवर्तनों की एक श्रृंखला प्रेरित किया जा सकता है, जो ब्याज12के प्रोटीन के व्यक्तिगत डोमेन के कार्यों को समझ सकते हैं. इसके अलावा, TILLING जीनोम भर में उत्परिवर्तनों का एक अमर संग्रह उत्पन्न करता है; इस प्रकार, एक एकल जनसंख्या एकाधिक जीनों के कार्यात्मक सत्यापन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके विपरीत, अन्य रिवर्स जेनेटिक्स उपकरण केवल अध्ययन13के अधीन जीन के लिए विशिष्ट संसाधन उत्पन्न करते हैं। TILLING के माध्यम से पहचान े लिए गए उपयोगी उत्परिवर्तनों को प्रजनन उद्देश्यों के लिए तैनात किया जा सकता है और जीन संपादन के विपरीत विनियमन के अधीन नहीं हैं, जिनका गैर-ट्रांसजेनिक वर्गीकरण कई देशों में अभी भी अनिश्चित है। यह विशेष रूप से छोटे अनाजों के लिए प्रासंगिक हो जाता है जो अंतर्राष्ट्रीय स्तर पर14का व्यापार करते हैं .
TILLING एक सरल और कुशल जीन सत्यापन रणनीति है और ब्याज के जीन की जांच के लिए विकसित किया जा करने के लिए mutagenized आबादी की आवश्यकता है. एक प्रभावी mutagenized आबादी का विकास एक TILLING आधारित जीन सत्यापन अध्ययन की दक्षता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक कम समग्र उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ एक TILLING जनसंख्या इंगित करता है कि एक अव्यावहारिक बड़ी आबादी वांछित उत्परिवर्तनों के लिए जांच की जानी चाहिए, जबकि एक उच्च mutagen एकाग्रता जनसंख्या में उच्च मृत्यु दर और की एक अपर्याप्त संख्या की ओर जाता है mutagenized व्यक्तियों. एक बार एक अच्छी आबादी विकसित की है, वहाँ ब्याज के जीन में उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए कई तरीके हैं, और मंच का चुनाव प्रयोगात्मक पैमाने और संसाधनों की उपलब्धता पर निर्भर करता है. संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण और बाह्य अनुक्रमण का प्रयोग पौधों में पौधों में सभी उत्परिवर्तनों को छोटे जीनोम ों के साथ15,16में बदलने के लिए किया गया है . दो टिलरिंग आबादी का एकोम अनुक्रमण रोटी और ड्यूरम गेहूं में किया गया है और वांछनीय उत्परिवर्तनों की पहचान करने और ब्याज की उत्परिवर्ती लाइनों के आदेश के लिए जनता के लिए उपलब्ध है17. यह वांछनीय उत्परिवर्तनों की उपलब्धता के संदर्भ में एक महान सार्वजनिक संसाधन है; हालांकि, जीन सत्यापन अध्ययन में, जंगली प्रकार लाइन ब्याज की उम्मीदवार जीन के अधिकारी होना चाहिए. दुर्भाग्य से, यह अभी भी एक और पृष्ठभूमि में कुछ उम्मीदवार जीन के रिवर्स आनुवंशिकी आधारित सत्यापन के लिए पूरे TILLING आबादी के exome अनुक्रम करने के लिए लागत-निरोधी है. Amplicon अनुक्रमण और Cel-1 आधारित परख गेहूं में लक्षित आबादी में उत्परिवर्तनों का पता लगाने में इस्तेमाल किया गया है, और Cel-1 परख सरल कर रहे हैं, कोई कम्प्यूटेशनल ज्ञान की आवश्यकता होती है, और बुनियादी के साथ जीन की एक छोटी संख्या के सत्यापन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं प्रयोगशाला उपकरण6,18.
वर्तमान लेख में, वर्णित एक अच्छा TILLING आबादी के विकास के लिए तरीके हैं, खुराक वक्र की तैयारी सहित, mutagenesis और उत्परिवर्ती आबादी के रखरखाव, और पीसीआर आधारित Cel-1 परख का उपयोग उत्परिवर्ती आबादी की स्क्रीनिंग . इस प्रोटोकॉल को पहले से ही ट्राइटिकम एस्टिवमकी म्यूटेजेनीकृत आबादी के विकास और उपयोग में सफलतापूर्वक लागू किया गया है , ट्राइटिकम मोनोकोकम6, जौ , एजिलॉप्स टाउचीई7, और कई दूसरों. शामिल उपयोगी सुझाव है कि शोधकर्ताओं की आबादी को विकसित करने में मदद मिलेगी के साथ इन तरीकों का स्पष्ट विवरण कर रहे हैं, पसंद के किसी भी छोटे अनाज संयंत्र में एक mutagen के रूप में ईएमएस का उपयोग कर.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING जीन सत्यापन के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान रिवर्स आनुवंशिकी उपकरण है, विशेष रूप से छोटे अनाज के लिए जहां परिवर्तन आधारित दृष्टिकोण गंभीर बाधाओं11है. एक उच्च उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ एक mutagenized आ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को यूएसडीए राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान, हैच परियोजना 1016879 और मैरीलैंड कृषि प्रयोग स्टेशन द्वारा MAES अनुदान संख्या 2956952 के माध्यम से समर्थित किया गया था।
Materials
| 96 well 1.1 ml microtubes in microracks | National Scientific | TN0946-08R | For collecting leaf tissues |
| Agarose I biotechnology grade | VWR | 0710-500G | |
| Biosprint 96 DNA Plant Kit | Qiagen | 941558 | Kit for DNA extraction |
| Cel-1 endonuclease | Extracted as described by Till et al 2006 | Single strand specific endonuclease | |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | ||
| Ethyl methanesulfonate | Sigma Aldrich | M-0880-25G | EMS, Chemical mutagen |
| Freeze Dry/Shell freeze system | Labconco | For lyophilization of leaf tissue | |
| Kingfisher Flex purification system | Thermo fisher scientific | 5400610 | High throughput DNA extraction robot |
| My Taq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | |
| Nuclease free water | Sigma aldrich | W4502-1L | |
| NuGenius gel imaging system | Syngene | ||
| Orbit Environ-shaker | Lab-line | ||
| SPECTROstar Nano | BMG LABTECH | Nano drop for DNA quantification | |
| T100 Thermal cycler | BIO-RAD | 1861096 |
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